Содержание

— трансляция — Биохимия

Трансляция (синтез белка)

Трансляция (англ. translation – перевод) – это биосинтез белка на матрице мРНК.

После переноса информации с ДНК на матричную РНК начинается синтез белков. Каждая зрелая мРНК несет информацию только об одной полипептидной цепи. Если клетке необходимы другие белки, то необходимо транскрибировать мРНК с иных участков ДНК.

Биосинтез белков или трансляция происходит на рибосомах, внутриклеточных белоксинтезирующих органеллах, и включает 5 ключевых элементов:

  • матрица – матричная РНК,
  • растущая цепь – полипептид,
  • субстрат для синтеза – 20 протеиногенных аминокислот,
  • источник энергии – ГТФ,
  • рибосомальные белки, рРНК и белковые факторы.

Выделяют три основных стадии трансляции: инициация, элонгация, терминация.

Инициация

Для инициации необходимы мРНК, ГТФ, малая и большая субъединицы рибосомы, три белковых фактора инициации (ИФ-1, ИФ-2, ИФ-3), метионин и тРНК для метионина.

В начале этой стадии формируются два тройных комплекса: 

  • первый комплекс – мРНК + малая субъединица + ИФ-3,
  • второй комплекс – метионил-тРНК + ИФ-2 + ГТФ.

После формирования тройные комплексы объединяются с большой субъединицей рибосомы. В этом процессе активно участвуют белковые факторы инициации, источником энергии служит ГТФ. После сборки комплекса инициирующая метионил-тРНК связывается с первым кодоном АУГ матричной РНК и располагается в П-центре (пептидильный центр) большой субъединицы. А-центр (аминоацильный центр) остается свободным, он будет задействован на стадии элонгации для связывания аминоацил-тРНК.

События стадии инициации

После присоединения большой субъединицы начинается стадия элонгации.

Элонгация

Для этой стадии необходимы все 20 аминокислот, тРНК для всех аминокислот, белковые факторы элонгации, ГТФ. Удлинение цепи происходит со скоростью примерно 20 аминокислот в секунду.

Элонгация представляет собой циклический процесс. Первый цикл (и следующие циклы) элонгации включает три шага:

  1. Присоединение аминоацил-тРНК (еще  второй)  к кодону мРНК (еще второму),  аминокислота при этом встраивается в А-центр рибосомы. Источником энергии служит ГТФ.
  2. Фермент пептидилтрансфераза осуществляет перенос метионина с метионил-тРНК (в П-центре) на вторую аминоацил-тРНК (в А-центре) с образованием пептидной связи между метионином и второй аминокислотой. При этом уже активированная СООН-группа метионина связывается со свободной NH
    2
    -группой второй аминокислоты. Здесь источником энергии служит макроэргическая связь между аминокислотой и тРНК.
  1. Фермент транслоказа перемещает мРНК относительно рибосомы таким образом, что первый кодон АУГ оказывается вне рибосомы, второй кодон (на рисунке ) становится напротив П-центра, напротив А-центра оказывается третий кодон (на рисунке ). Для этих процессов необходима затрата энергии ГТФ. Так как вместе с мРНК перемещаются закрепленные на ней тРНК, то инициирующая первая тРНК выходит из рибосомы, вторая тРНК с дипептидом помещается в П-центр.
Последовательность событий стадии элонгации

Второе повторение цикла – начинается с присоединения третьей аминоацил-тРНК к третьему кодону мРНК, аминокислота-3 становится в А-центр. Далее трансферазная реакции повторяется и образуется трипептид, занимающий А-центр, после чего он смещается в П-центр в транслоказной реакции..

В пустой А-центр входит четвертая аминоацил-тРНК и начинается третий цикл элонгации:

Образование пептидной связи при встраивании четвертой аминокислоты в пептид.

Субъединицы рибосомы, большая часть транспортных РНК и матричная РНК не показаны.

Цикл элонгации (реакции 1,2,3) повторяется столько раз, сколько аминокислот необходимо включить в полипептидную цепь.

Терминация

Синтез белка продолжается до тех пор, пока рибосома не достигнет на мРНК особых терминирующих кодонов – стоп-кодонов УАА, УАГ, УГА. Данные триплеты не кодируют ни одной из аминокислот, их также называют нонсенс-кодоны. При вхождении этих кодонов внутрь рибосомы происходит активация белковых факторов терминации, которые последовательно катализируют:

  1. Гидролитическое отщепление полипептида от конечной тРНК.
  2. Отделение от П-центра последней, уже пустой, тРНК.
  3. Диссоциацию рибосомы.

Источником энергии для завершения трансляции является ГТФ.

Реакции стадии терминации

Полирибосомы

По причине того, что продолжительность жизни матричной РНК невелика, перед клеткой стоит задача использовать ее максимально эффективно, т.е. получить максимальное количество «белковых копий». Для достижения этой цели на каждой мРНК может располагаться не одна, а несколько рибосом, встающих последовательно друг за другом и синтезирующих пептидные цепи. Такие образования называются

полирибосомы.

Транслируйте свой геймплей с помощью GeForce Experience Share

GeForce Experience позволяет с легкостью транслировать онлайн геймплей со своего ПК на выбранный сервис. GeForce Experience поддерживает онлайн трансляцию в Facebook Live, YouTube Live и Twitch. Хотя каждый из этих сервисов уникален и имеет свои правила создания аккаунта, пользовательский интерфейс и аудиторию, GeForce Experience объединяет доступ к ним в одном удобном интерфейсе, позволяя не тратить время на установку и не запоминать множество паролей.

Обязательные требования

Помимо требования иметь аккаунт GFE, настоящее руководство подразумевает, что у вас уже есть аккаунт в Facebook, Twitch или YouTube. Если у вас еще нет аккаунта на сервисе, которым вы хотите воспользоваться, пожалуйста, зарегистрируйтесь на http://www.facebook.com, http:/www.twitch.tv или http://www.youtube.com. Создание аккаунта GFE – это разовый процесс, который необходимо завершить после первой установки GFE, следуя инструкциям на экране.

Первоначальная настройка

Чтобы настроить трансляцию с помощью GeForce Experience:

  1. Нажмите Alt+Z, чтобы вызвать оверлей Share, и войдите в
    Параметры
    :
  2. ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ: Если оверлей Share не появляется на экране, возможно, он отключен. Вы можете включить его, зайдя в GeForce Experience в Параметры > ОБЩИЕ > SHARE и переключить тумблер. Загорится зеленый индикатор, сигнализирующий, что оверлей Share включен.

    ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ: Вы можете изменить клавиши быстрого доступа к оверлею Share. Для этого зайдите в Параметры > Сочетания клавиш, если вы не хотите использовать комбинацию Alt+Z.

  3. В меню Параметры выберите Трансляция:
  4. В окне Трансляция нажмите Да, чтобы включить трансляцию с ПК. Также вы можете настроить пользовательские оверлеи или сменить сервер для трансляции в Twitch. После завершения нажмите кнопку Назад.
  5. Вы вернетесь в меню Параметры . После выполнения этого шага переходите к следующему разделу руководства, Подключение к сервисам трансляции .

Подключение к сервисам трансляции

GeForce Experience поддерживает трансляцию в Facebook Live, Twitch и YouTube Live. В этом разделе вы узнаете, как настроить трансляцию для этих сервисов.

Чтобы подключиться к сервису:

  1. Убедитесь, что вы выполнили Первоначальную настройку. Затем откройте (или вернитесь) в оверлее Share в меню Параметры и нажмите Подключиться:
  2. В окне Подключиться выберите аккаунт и нажмите Войти. К примеру, вы хотите подключиться к Facebook Live:
  3. Выполнив все перечисленные выше шаги, вам потребуется ввести свой электронный адрес или телефон и пароль, чтобы войти в аккаунт Facebook:
  4. После того как вы войдете в аккаунт Facebook, вы увидите на экране фото своего профиля, имя пользователя и статус подключения:
  5. Ваш аккаунт Facebook будет подключен до тех пор, пока вы не выберете в окне Подключиться свой аккаунт и не нажмете кнопку Выйти.

Настройки трансляции

В зависимости от пропускной способности вашей сети вы можете понизить или повысить определенные параметры трансляции, например, разрешение, частоту смеын кадров или битрейт. Чтобы изменить параметры трансляции:

  1. Нажмите Alt+Z, чтобы вызвать оверлей Share, и выберите меню Трансляция > Настройки:
  2. Здесь вы можете задать желаемое разрешение, частоту смены кадров и битрейт трансляции. Также для вашего удобства доступны предустановленные настройки:
  3. Завершив настроку, нажмите кнопку Сохранить.

ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ: Вы можете настраивать качество трансляции отдельно для каждого сервиса.

Настройка вебкамеры и микрофона

Если к ПК подключены вебкамера и микрофон или вебкамера со встроенным микрофоном, вы можете использовать их во время трансляции с помощью GeForce Experience.

Чтобы установить микрофон:

  1. Нажмите Alt+Z, чтобы вызвать оверлей Share, и нажмите на значок микрофона:
  2. Откроется меню с опциями Push-to-talk, Всегда вкл., Выкл. и Настройки. Откройте Настройки, чтобы выбрать. Какой микрофон использовать, настроить громкость микрофона и усиление громкости.

Чтобы установить вебкамеру:

  1. Нажмите Alt+Z, чтобы открыть оверлей Share, и выберите меню Параметры.
  2. Здесь выберите Наложения.
  3. В меню Положение вы можете выбрать сектор, в котором будет отображаться ваша вебкамера или выключить ее. Также можно настроить размер отображения вебкамеры:
  4. Завершив настройку, нажмите кнопку Назад. Теперь ваша вебкамера готова к трансляции.

ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ: Вы можете включить или выключить микрофон и вебкамеру в любой момент во время трансляции, просто нажав Alt+Z (это откроет оверлей Share) и нажав на значок микрофона или камеры.

Начало трансляции

Для примера мы будем транслировать геймплей в Facebook Live, хотя все шаги, которые необходимо для этого выполнить, схожи с шагами для трансляции в Twitch или YouTube Live.

Прежде чем начать трансляцию, убедитесь, что вы подключили и настроили все необходимые устройства. Смотрите разделы Первоначальная настройка и Подключение к сервисам трансляции.

Чтобы начать трансляцию в Facebook Live:

  1. Запустите игру на ПК.
  2. Когда будете начать трансляцию, нажмите Alt+Z, чтобы открыть оверлей Share.
  3. Выберите меню Трансляция и нажмите Начать.
  4. Когда появится диалоговое окно Трансляция , выберите сервис, на который вы хотите транслировать свою игру. В нашем случае мы выбрали Facebook.
  5. Обратите внимание, что в этом окне вы можете указать Название, Местоположение и Аудиторию для трансляции. Эти опции зависят от выбранного вами сервиса.
  6. Чтобы начать трансляцию, нажмите кнопку Начать.
  7. Теперь ваша игра транслируется в Facebook! Обратите внимание, что во время трансляции значок трансляции горит зеленым и изменился статус:

  8. Чтобы остановить трансляцию, нажмите Alt+Z, чтобы открыть оверлей Share, выберите Трансляция и нажмите Остановить.

ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ: Если вы хотите настроить трансляцию или внести изменения в общие настройки, сначала необходимо остановить трансляцию.

ОБРАТИТЕ ВНИМАНИЕ: Транслировать геймплей в один момент времени можно только на один сервис.

Доступ к трансляции

Во время трансляции игрового процесса ваши друзья или любые другие пользователи (в зависимости от того, что вы выбрали в опции «Аудитория») могут смотреть ваш геймплей. Ваша трансляция доступна в Facebook через веб-браузер и приложение Facebook на любом поддерживаемом мобильном устройстве.

Чтобы смотреть вашу трансляцию в Facebook, пользователям необходимо:

  1. Открыть Хронику или страницу, которую вы указали в опции «Местоположение» в начале трансляции.
  2. Facebook автоматически уведомит ваших друзей. Ваши зрители смогут общаться с вами посредством эмотиконов и комментариев:
  3. Когда вы остановили трансляцию, Facebook сохранит видео, чтобы его можно было просматривать в будущем. Вы сможете читать и отвечать на все комментарии к своей трансляции в Facebook.

С этим руководством теперь вы сможете транслировать свой геймплей с ПК для друзей и фанатов, ведь это так просто!

Оборудование для стрима: что нужно и как выбрать? — Блог

Видеотрансляции стали популярным способом проведения досуга и заработка — запись игр приносит геймерам и блогерам неплохой доход. Сегодня этот формат вышел далеко за прежние рамки, чему способствуют релизы новых игр. Например, Cyberpunk 2077 — самая ожидаемая игра этого года, выпуск которой запланирован на 10 декабря. Статистика, опросы и заинтересованность публики подтверждают ее популярность: по данным отчета польских аналитиков из компании DM BOŚ, до конца 2020 года будет реализован 21 млн копий игры, а еще через год тираж превысит 34 млн.

Выход Cyberpunk 2077 является отличным поводом начать карьеру стримера и завоевать широкую аудиторию. Однако чтобы геймплеи пользовались популярностью, необходимо качественное оборудование для трансляций: камера, карта захвата, микрофон и гарнитура.

Содержание

  1. Как выбрать камеру для стрима
  2. Важные параметры для выбора камеры
  3. Топ-3 популярных веб-камеры для стриминга
  4. Нужен ли встроенный микрофон?
  5. Как работает цветокоррекция?
  6. Таблица сравнения веб-камер
  7. Топ-3 производительных модели карт захвата
  8. Как выбрать гарнитуру и микрофон для игр и стриминга
  9. Важные параметры при выборе микрофона

Как выбрать камеру для стрима

Камера — это незаменимое устройство для проведения онлайн-трансляций. Как показывает практика, стримы с изображением автора намного популярнее обычных. Таким образом камера помогает зрителям воспринимать контент, который демонстрируется на экране, как нечто новое и уникальное, а не просто кадры из игры. Дополнительно это помогает укрепить и наладить связь между стримером и аудиторией. Любой, даже самый хороший и интересный стрим, может быть испорчен плохим изображением с замыленным лицом стримера в разрешении 480p, что надолго ухудшит впечатление зрителям.

Если запись игры планируется проводить на ноутбуке, пусть вас не сбивает с толку наличие встроенной камеры. От ее использования может пострадать не только качество изображения, но и ваша мобильность, а также уровень комфорта – изменить положение камеры прямо во время трансляции будет неуместно и публике придется смотреть на ваш потолок или половину лица. Поэтому во избежание некачественной картинки, стоит задуматься о приобретении внешней камеры. Чтобы вы знали какие модели наиболее популярны среди стримеров и на что обратить внимание при выборе веб-камер, мы подготовили для вас полезную подборку с примерами устройств.

Важные параметры для выбора камеры:

  1. Количество пикселей матрицы: миниумм от 2 Мп, но лучше 3 и более.
  2. Разрешение матрицы не менее HD (лучше Full HD) для передачи качественной картинки без искажений.
  3. Кадровая частота не менее 30 в секунду, чтобы обеспечить плавность видео без рывков.
  4. Хорошая светочувствительная матрица:
    • CMOS — потребляет мало энергии и быстро считывает изображение, однако может иметь низкую чувствительность, которая приводит к увеличению помех на изображении или искажению быстро движущихся объектов.
    • CCD — устаревший тип, которого следует избегать
  5. Угол обзора в зависимости от целей: чем шире угол — тем больше пространства попадет в кадр, золотая середина около 60°.
  6. Тип фокусировки: автоматический, для самостоятельной настройки камерой наиболее качественного изображения.
  7. Длина кабеля для подключения к ПК не менее 1,5 м (при подключении к ноутбуку не играет роли).
  8. Подключение по USB.

Примечание: видеокамера для трансляции с компьютера или ноутбука обычно подключается по USB. Важно учесть, если не указано, какая из версий этого стандарта используется, подразумевается USB 2.0. По возможности стоит отдавать предпочтение моделям с USB 3.0. Они обеспечивают более быстрый обмен данными.

Далее мы рассмотрим несколько наиболее подходящих, на наш взгляд, веб-камер для стрима.

Топ-3 популярных веб-камеры для стриминга

Устройство поддерживает разрешение Full HD при 30 кадрах в секунду (HD при 60 кадров в секунду) и оборудовано встроенным микрофоном. Захват звука лучше, чем в некоторых камерах от Logitech, но все же качества микрофона недостаточно для создания отличного контента. Особенность данной модели — встроенная подсветка, которая сделана в виде маленького светящегося круга, имитирующего софтбокс. Конечно, подобное решение не подходит для выстраивания хорошего света, однако лучше, чем ничего. Камера не имеет фирменного приложения, но совместима с Open Broadcaster Software и Xsplit, которые позволяют внести любые необходимые настройки. В итоге это хороший конкурент моделям веб-камер С920 – 930 от Logitech.

Logitech BRIO — высококлассная веб-камера, которая отличается элегантным дизайном и поддержкой разрешения видео 4К при 30 кадрах в секунду (при 1080p этот показатель составляет 60, а при 720p — 90 кадров в секунду). 8-мегапиксельная камера также оснащена стереомикрофоном, однако как писали ранее, любой стример неизбежно захочет более профессиональное и качественное устройство для передачи звука. Для наиболее точного кадрирования изображения устройство имеет несколько режимов с углом обзора в 65, 78 и 90 градусов. Logitech BRIO сочетает в себе высокое качество съемки, стильный дизайн и широкий угол обзора.

Logitech C922x — веб-камера с разрешением 1080p, 15-мегапиксельным сенсором и высококачественным объективом. Устройство также оснащено двумя микрофонами, что все равно не позволяет им составить конкуренцию качественному внешнему микрофону, однако для подстраховки вполне подойдут. В модели C922 применяются технологии автоматической фокусировки и коррекции уровня освещенности в формате HD, поэтому изображение будет исключительно четким и детализированным даже при отсутствии достаточно ярких источников света.

Нужен ли встроенный микрофон?

Стоит учитывать, что веб-камеры оборудованы самыми обычными микрофонами, которые подходят для простых видеозвонков, но не дают качественный звук при записи стримов. Чтобы профессионально записывать стримы, в любом случае необходим внешний микрофон или, как минимум, гарнитура. Данные устройства однозначно намного лучше встроенных и обеспечивают более естественное звучание, что существенно влияет на общее качество стрима. К тому же, зачастую внешние микрофоны оборудованы дополнительным функционалом, например, фильтр низких частот или кнопки отключения и регулировки звука. Поэтому не стоит обращать внимание на качество звукозаписи веб-камеры или вообще поискать вариант без микрофона. Данное устройство стоит купить отдельно.

Как работает цветокоррекция?

Подсветка может быть встроена в камеру, однако это не гарантирует достаточную освещенность при записи стрима. Считается, что правильно поставленный свет — это половина успеха. Технологии автоматической коррекции цвета и света влияют на общее качество изображения намного сильнее, чем может сперва показаться. Ведь именно плохое освещение чаще всего становится главной причиной некачественного видео, потому что камеры зачастую не могут выдавать хорошую картинку в полумраке. Стоит учесть, что чем лучше освещенность, тем более четкое и красивое изображение вы получите на выходе. Поэтому имеет смысл выбрать качественные осветительные устройства и дополнительно не переплачивать за посредственную подсветку в камере.

Ниже представлена сводная таблица сравнения веб-камер:

Параметры Logitech C922 Logitech BRIO Razer Kiyo
Максимальное разрешение 1920×1080,  4К, 1920×1080, 1280×720 1920×1080

1280×720

Кадры в секунду 30 30, 30/60, 30/60/90 30,60
Угол обзора 90 90/78/65 81,6
Число мегапикселей матрицы 2 Мп 8 Мп 4 Мп
HDR нет есть нет
Фокус авто авто авто
Микрофон стерео стерео моно
Особенности Поставляется с премиум-лицензией XSplit на 3 месяца (ПО для видеотрансляций) и штативом Защитная шторка для объектива и футляр для переноски в комплекте Встроенная подсветка

Как выбрать карту видеозахвата для стрима

Еще одним необходимым устройством для записи игрового контента является карта захвата, которая во время трансляции без задержек передает изображение и звук с ваших ПК или игровой консоли. При этом существенно снижается нагрузка на компьютер за счет того, что не нужно тратить аппаратные ресурсы на запись и обработку видео.

Самая важная характеристика для всех карт видеозахвата — сквозное разрешение: параметр определяет, какую картинку конкретное устройство готово считать и передать на компьютер для трансляции. Ниже представлен обзор 3-х производительных карт захвата от нашего эксперта.

Топ-3 производительных модели карт захвата

Одна из самых недорогих карт видеозахвата в компактном корпусе с размерами 100×57×188 мм и весом 74,5 г. Устройство может обрабатывать видео в разрешении Full HD при частоте 60 кадров в секунду (FPS) и передавать в таком же качестве, с незначительными потерями и без задержек, что наиболее важно для трансляции игрового контента. Еще одним преимуществом является поддержка функции ChromaKey, что позволяет накладывать друг на друга два потока видео в реальном времени. Есть возможность установить простое и удобное в использовании фирменное приложение — AverMedia Assist Central.

Массивная модель с размерами 105×85×16 мм и весом 150 г. Карта выполнена в лаконичном и узнаваемом дизайне игрового бренда с подсветкой. Устройство обеспечивает передачу качественной Full HD-картинки и может захватить сквозной 4K при 60 FPS для непрерывного и плавного игрового процесса. Преимуществом девайса является наличие AUX-входа для наушников и отдельный вход для микрофона, благодаря чему можно одновременно захватывать звук из наушников и микрофона.

Устройство хорошо справляется с передачей качественного изображения Full HD при 60 FPS по сквозному разрешению с приставки на компьютер без задержек и потери качества. Главное отличие от AverMedia: вместо micro-USB 2.0 здесь более скоростной разъём Type-C 3.0, а кроме HDMI и USB есть вход AUX для наушников. Особенностью карты является многофункциональное фирменное приложение Game Capture HD, которое позволяет вести трансляцию и записывать её на ПК без потери качества и увеличения нагрузки.

Как выбрать гарнитуру и микрофон для игр и стриминга

Хотя некоторые стримеры используют микрофон своей игровой гарнитуры, наличие отдельного специализированного устройства может обеспечить гораздо лучшее качество звучания. Если без веб-камеры стримеру еще можно обойтись, то без микрофона совсем никак. Зрители приходят на стрим именно для того, чтобы послушать, как вы проходите игру или комментируете другие действия. Поэтому очень важно, чтобы звук был качественным. С хорошим микрофоном для потокового вещания ваш голос будет слышен громко и отчетливо в любых условиях.

Важные параметры при выборе микрофона:

  • Частотный диапазон от 20 Гц до 20 кГц, чтобы качественно захватывать любые звуки.
  • Направленность: кардиоидная или мультинаправленная(с возможностью изменения параметров).
  • Чувствительность: от 40 дБ.
  • Подключение по USB, для более простой настройки и универсальности.
  • Длина кабеля, соответствующая вашим потребностям.
  • Дополнительные аксессуары в комплекте: настольная стойка или подставка, адаптер.

Микрофон AVerMedia Live Streamer MIC 133 – это компактный однонаправленный микрофон, который разработан специально для онлайн-трансляций стримеров и создателей контента, которым необходимо качественное звучание голоса. В комплект модели MIC 133 входит металлическая подставка для использования на рабочем месте рядом с компьютером и аудио-кабель с 4-контактным и 3-контактным разъемом 3,5 мм для одновременного подключения микрофона и наушников к смартфону. это позволит вам контролировать звукозапись без необходимости отключения микрофона.

Микрофон AVerMedia AM310 USB – это конденсаторный микрофон студийного класса с USB-интерфейсом, который не требует наличия промежуточных микшерских пультов, предусилителей и прочего. В комплекте с микрофоном поставляется специальная удобная подставка, собрать которую не составит труда.А благодаря отсутствию драйверов, подключение модели AM310 к ПК через любой USB-порт осуществляется легко и без необходимости установки дополнительного ПО. Микрофону также не требуется дополнительное питание – напряжение вырабатывается с помощью повышающего трансформатора непосредственно в самом микрофоне от шины USB.

Продолжаем развивать тему звука. Золотое правило любого стримера — не проводить стримы через колонки! Лучше всегда использовать наушники, иначе звук будет намного хуже из-за шума, помех и эха. Представленные ниже гарнитуры — это проверенные игровые наушники с микрофоном, которые обладают отличным качеством записи микрофона и хорошим звучанием.

Гарнитура AVerMedia SonicWave Gh437 Black – качественные полноразмерные наушники для стримеров. Хороший звук, удобная посадка и очень неплохой микрофон – всё, что нужно. В этих наушниках можно неплохо вести игровые стримы. Благодаря технологии шумоподавления с двумя микрофонами Gh437 отфильтровывает окружающий шум и сохраняет чистый звук.

Гарнитура AVerMedia SonicWave Gh435 Black – спроектированная специально для игр, Gh435 настроена на определенную конфигурацию звуковой кривой, чтобы передавать детальный захватывающий звук игр. Вы можете легко услышать шаги врагов, специальные сигналы атаки, звуки боя для вас станут слышны как никогда, давая вам преимущество перед вашими соперниками.

Итог

Как всегда, выбор устройств зависит от личных потребностей и вашего бюджета. Поэтому мы сделали небольшую подборку, в которой показали насколько важны те или иные функции и на какие стоит обратить особое внимание, если вы хотите выбрать идеальную веб-камеру, карту захвата, гарнитуру или микрофон под свои нужды.

Читайте также

Мировая премьера «Аркейна»: трансляции и награды

Мировая премьера дебютного сериала от Riot под названием «Аркейн» состоится на платформе Netflix в воскресенье 7 ноября в 05:00 по московскому времени. «Аркейн» станет первым шоу на Netflix, премьеру которого можно будет транслировать на Twitch в совместном режиме. Мы приглашаем создателей контента со всего мира принять участие в этом знаменательном событии и реагировать на происходящее вместе со своими зрителями!

Если вы хотите транслировать первую серию «Аркейна» во время мировой премьеры в совместном режиме вместе с нами, ознакомьтесь с нашим руководством! 

  • Когда: трансляция мировой примеры «Аркейна» начнется на канале Riot Games в Twitch и сайте Arcane.com 7 ноября примерно в 03:30 по московскому времени, а начало показа первой серии ожидается в 05:00. Повторная трансляция первой серии для EU пройдет 7 ноября в 13:00 по московскому времени. Вы можете проводить совместные трансляции «Аркейна» на Twitch только в эти временные периоды.
     
  • Где: на вашем канале Twitch. Транслировать серию и другой контент в совместном режиме на других платформах запрещено. Кроме того, запрещены и записи трансляции (VOD) события и серии – даже на Twitch. Посетите страницу, посвященную VOD на Twitch, чтобы узнать, как отключить записи/клипы до начала совместной трансляции.
     
  • Как: используйте хештег #ArcaneCostream в заголовках совместных трансляций в категории «Аркейн» и в социальных сетях. Чтобы узнать, как проводить совместные трансляции, читайте статью «Рекомендации по размещению чужого контента» на Twitch.
     
  • Монетизация: мы понимаем, что этот вопрос важен для всех наших создателей контента. На совместных трансляциях на Twitch можно будет использовать стандартную монетизацию. Спонсорам необходимо соблюдать стандартные правила спонсорства в League of Legends. 

Пожалуйста, будьте ответственными и проявляйте уважение, а также придерживайтесь «Юридической писанины» Riot. Riot Games и Netflix оставляют за собой право лишить возможности вести совместную трансляцию любого пользователя в любое время. 

Игроки, которые будут смотреть трансляцию мировой премьеры «Аркейна» на Twitch и Arcane.com, также смогут получить Twitch Drops с эксклюзивными наградами для разных игр Riot. Для этого ваша учетная запись должна быть привязана к Twitch на странице «Подключения».

Получить эксклюзивные Twitch Drops можно в любом из перечисленных ниже мест.

  • Трансляция мировой премьеры «Аркейна» на Twitch.
     
  • Совместная трансляция мировой премьеры «Аркейна» и 1-й серии «Аркейна» вашего любимого создателя контента на Twitch.
     
  • Arcane.com (после входа в учетную запись Riot).
     
  • Совместные трансляции 2-й и 3-й серий «Аркейна» избранных создателей контента на Twitch (список будет опубликован позже).
     
  • Повторная трансляция 1-й серии «Аркейна» для Европы на канале Riot Games на Twitch начнется 7 ноября 2021 года в 13:00 по московскому времени. 

Спасибо, что празднуете вместе с нами! Если у вас остались вопросы, пишите в поддержку творцов Riot Games в Twitter!

 

Организация онлайн-трансляции мероприятия в Москве

Онлайн-трансляция в Москве

В современных условиях города Москвы можно проводить различные события в online-трансляции. Это могут быть праздники, корпоративы, служебные совещания и другие события, которые можно транслировать по защищенным интернет-каналам в другие города. Online-трансляция открывает много возможностей для коммуникации не только внутри города, но и по всей стране.

Для заказа подготовки трансляции обратитесь в нашу компанию «МузПрокат». Мы предлагаем услугу проведения онлайн-трансляций под ключ в Москве на вашу аудиторию. Это инновационный способ освещения любых событий клиента станет правильным и выгодным решением в современных условиях. Такой метод поможет визуально объединить друзей, родственников, коллег, при этом они физически останутся на своих местах.

Трансляция события

Компания «МузПрокат» предлагает уникальный услугу– проведение интернет трансляции важных событий в жизни человека, компаний. Такой вариант подходит проведения телемоста конференций между участниками, находящихся в разных городах и даже странах.

Трансляция будет проходить в прямом эфире, при необходимости мы можем записывать ее:

Преимущества обращения в «МузПрокат» для проведения трансляций:

  1. Настроим на любом устройстве адаптивный интерфейс плеера;
  2. Организуем бесперебойную работу трансляции даже для слабого интернета, в т.ч. со скоростью менее 320 kbs;
  3. Создадим необходимое графическое оформление – заставку, титры, разъяснительные подписи;
  4. Обеспечим многоканальное подключение: к трансляции могут присоединиться неограниченное количество пользователей;
  5. Создадим красочное оформление закрытия трансляции;
  6. Поможем подготовить доступ по защищенным электронным билетам;
  7. Сделаем для зрителей интерактивный сервис поддержки – чат, голосование, опросы;
  8. По желанию клиента оформим трансляцию с корпоративной айдентикой.

Онлайн – трансляция интернет-события осуществляется при помощи поддержки современной техники. Вы можете заказать трансляции событий любого формата – от частной вечеринки до концертов, международных форумов, конгрессов, фестивалей, и пр.

Возможности подготовки трансляции

Цена организации трансляции под ключ будет зависеть от ваших требований и пожеланий, количества техники, и других запросов. Наши специалисты готовы ответить на все вопросы заказчика, оперативно рассчитают смету и озвучат стоимость услуги.

Заказанная у нас онлайн трансляция, дает дополнительные возможности:

  1. Мероприятие легко монетизировать, например, подготовить платный доступ;
  2. Запуск адаптивной рекламы поможет увеличить количество зрителей;
  3. Можно продавать запись контента, которая после окончания трансляции станет вашей интеллектуальной собственностью.

Для уточнения технических и организационных вопросов свяжитесь с нашим менеджером и получите бесплатную консультацию. Мы подберем для вас подходящий формат, аппаратуру, при этом обязательно учтем все ваши требования и пожелания. По запросу клиентов предоставим портфолио наших работ по подготовке подобных трансляций. Для клиентов мы разработали несколько тарифных планов с выгодными ценами, рассчитанными на любой бюджет заказчика.

Деловая программа 2021

Будущее угольной энергетики неразрывно связано с будущим рынка угля – одного из самых крупных в мире. В числе его базовых преимуществ: относительно невысокая цена, обилие запасов и развитая система поставок на мировой рынок, удобство создания резервов топлива и независимость от погодных условий, отсутствие требований к охраняемым маршрутам и геополитических ограничений, и т.д. Угольная генерация – основополагающий источник электроэнергии в Китае и Индии, а также во многих странах Юго-Восточной Азии; важный фактор борьбы с энергетической бедностью и увеличения занятости в угледобывающих регионах. Перспективы мировой металлургической, прежде всего сталелитейной, промышленности и смежных с ней отраслей, например, строительной, в настоящее время во многом определяются предложением и стоимостью коксующегося угля. Послекризисное восстановление спроса на этот вид угля – аналитики Platts отметили резкое, в 2,8 раз, увеличение объема спотовых сделок в первом полугодии 2021 г. на коксующийся уголь премиум-класса – привело в свою очередь к стремительному росту цен на это топливо. Вместе с тем в мире стремительно набирает силу тренд на энергетический переход, направленный на постепенное вытеснение ископаемых энергоресурсов, в первую очередь угля, из топливного баланса электростанций и топливно-энергетического баланса в целом для достижения углеродной нейтральности, введение различных регулятивных мер. Наиболее вероятно, что в ближайшие десятилетия развитие, в т.ч. инновационное угольного рынка, угольной генерации, и энергетический переход будут сосуществовать, оказывая различное влияние на динамику друг друга, и что еще важнее, на жизнь и благополучие десятков и сотен миллионов людей. Взгляд международного сообщества: каково будущее мировой угольной энергетики, и насколько Россия в тренде? Когда водород сможете конкурировать с углем в металлургии? В каких технологических процессах? Выгодна ли экологизация угольной энергетики с учетом развития иных видов генерации? Какие инструменты поддержки требуются для «нового начала» угольной энергетики? Какие перспективы у российских энергетических и коксующихся углей на мировом рынке? Насколько оправданы планы по сохранению объемов угольной генерации в Российской Федерации до 2035 г., в т.ч. с учетом последствий коронавирусной пандемии? Как выстроить экономически обоснованный, опирающийся на потенциал преобразований и стратегически выверенный путь развития угольной генерации в новых условиях?

Модератор:
Сергей Брилев — Телеведущий; президент, Ассоциация «Глобальная энергия»

Участники дискуссии:
Ирина Золотова — Директор центра отраслевых исследований и консалтинга, ФГОБУ ВО «Финансовый университет при Правительстве Российской Федерации»
Зинфер Исмагилов — Директор, ФГБУН «Институт углехимии и химического материаловедения Сибирского отделения Российской академии наук»

Требования к переводу | Биология для неспециалистов I

Результаты обучения

  • Опишите компоненты, необходимые для перевода

Рисунок 1. Пептидная связь соединяет карбоксильный конец одной аминокислоты с аминоконцом другой, вытесняя одну молекулу воды. Для простоты на этом изображении показаны только функциональные группы, участвующие в пептидной связи. Обозначения R и R’ относятся к остальной части каждой аминокислотной структуры.

Процесс трансляции или синтеза белка включает декодирование сообщения мРНК в полипептидный продукт.Аминокислоты ковалентно связаны между собой пептидными связями. Каждая отдельная аминокислота имеет аминогруппу (NH 2 ) и карбоксильную (COOH) группу. Полипептиды образуются, когда аминогруппа одной аминокислоты образует амидную (то есть пептидную) связь с карбоксильной группой другой аминокислоты (рис. 1).

Эта реакция катализируется рибосомами и генерирует одну молекулу воды.

Оборудование для синтеза белка

Помимо матрицы мРНК в процесс трансляции вносят вклад многие молекулы и макромолекулы.Для трансляции требуется ввод матрицы мРНК , рибосом , тРНК и различных ферментативных факторов.

Щелкните по шагам этого интерактивного PBS, чтобы увидеть синтез белка в действии.

Рибосомы

Рибосома представляет собой сложную макромолекулу, состоящую из структурных и каталитических рРНК и множества различных полипептидов. Рибосомы существуют в цитоплазме у прокариот и в цитоплазме и шероховатой эндоплазматической сети у эукариот. Рибосомы состоят из двух субъединиц.В E. coli малая субъединица описывается как 30S, а большая субъединица — как 50S, всего 70S. Рибосомы млекопитающих имеют небольшую субъединицу 40S и большую субъединицу 60S, всего 80S. Малая субъединица отвечает за связывание матрицы мРНК, тогда как большая субъединица последовательно связывает тРНК.

тРНК

тРНК представляют собой структурные молекулы РНК, которые были транскрибированы с генов РНК-полимеразой III. Выступая в качестве адаптеров, специфические тРНК связываются с последовательностями на матрице мРНК и добавляют соответствующую аминокислоту в полипептидную цепь.Следовательно, тРНК — это молекулы, которые фактически «переводят» язык РНК на язык белков.

Рисунок 2. Фенилаланиновая тРНК

Из 64 возможных кодонов мРНК — или триплетных комбинаций A, U, G и C — три определяют терминацию синтеза белка, а 61 определяют присоединение аминокислот к полипептидной цепи. Из этих 61 один кодон (AUG), также известный как «стартовый кодон», кодирует инициацию трансляции. Каждый антикодон тРНК может образовывать пару оснований с одним из кодонов мРНК и добавлять аминокислоту или терминировать трансляцию в соответствии с генетическим кодом.Например, если последовательность CUA встречается на матрице мРНК в соответствующей рамке считывания, она будет связывать тРНК, экспрессирующую комплементарную последовательность GAU, которая будет связана с аминокислотой лейцином.

Зрелые тРНК

приобретают трехмерную структуру за счет внутримолекулярной водородной связи, чтобы расположить сайт связывания аминокислоты на одном конце и антикодон на другом конце (рис. 2). Антикодон представляет собой трехнуклеотидную последовательность в тРНК, которая взаимодействует с кодоном мРНК посредством комплементарного спаривания оснований.

тРНК должны взаимодействовать с тремя факторами:

  1. Они должны распознаваться правильной аминоацилсинтетазой.
  2. Они должны быть распознаны рибосомами.
  3. Они должны связываться с правильной последовательностью мРНК.

Аминоацил-тРНК-синтетазы

В процессе «зарядки» тРНК каждая молекула тРНК связывается с соответствующей аминокислотой группой ферментов, называемых аминоацил-тРНК-синтетазами. Для каждой из 20 аминокислот существует по крайней мере один тип аминоацил-тРНК-синтетазы .

Поддержите!

У вас есть идеи по улучшению этого контента? Мы будем признательны за ваш вклад.

Улучшить эту страницуПодробнее

Синтез белка (перевод) — определение, ферменты, этапы, ингибиторы

Главная » Молекулярная биология » Синтез белка (перевод) — определение, ферменты, этапы, ингибиторы

Что такое синтез белка?

Синтез белков — это процесс синтеза белков в цепи аминокислот, известных как полипептиды.Это вторая часть центральной догмы генетики.

  • Это происходит в рибосомах, находящихся в цитозоле или прикрепленных к шероховатой эндоплазматической сети.
  • Функции рибосомы заключаются в считывании последовательности кодонов в мРНК и молекулах тРНК, которые переносят или транспортируют или доставляют аминокислоты к рибосомам в правильной последовательности. Однако в процессе трансляции участвуют и другие молекулы, такие как различные ферментативные факторы.
  • Процесс трансляции включает чтение генетического кода в мРНК для создания белков.
  • Весь процесс трансляции можно разделить на три фазы: инициация, удлинение и терминация.

Рисунок: Центральная догма.

Оборудование для синтеза белка

Процессу трансляции способствуют два основных фактора: Транслятор – это молекула, которая осуществляет трансляцию; субстрат – здесь мРНК транслируется в новый белок (переводчик).Процесс трансляции управляется механизмом, состоящим из:

Рибосом
  • Рибосомы состоят из рибосомной РНК (рРНК) и белков, поэтому их также называют рибозимами, поскольку рРНК обладает ферментативной активностью. рРНК обладает пептидилтрансферазной активностью, которая связывает аминокислоты.
  • Рибосомы состоят из двух субъединиц рРНК и белков, большой субъединицы с тремя активными центрами (Е, Р, А), которые имеют решающее значение для каталитической активности рибосом.

Транспортная РНК (тРНК)
  • Каждая тРНК имеет антикодон для кодона аминокислоты, который она несет, которые комплементарны друг другу. Например; Лизин кодируется AAG, поэтому антикодон, который будет переноситься тРНК, будет UUC, поэтому, когда появится кодон AAG, с ним временно свяжется антикодон UUC тРНК.
  • Когда тРНК связывается с мРНК, тРНК высвобождает свою аминокислоту. Затем рРНК помогает образовывать связи между аминокислотами, когда они транспортируются к рибосомам одна за другой, создавая таким образом полипептидную цепь.Полипептидная цепь продолжает расти, пока не достигнет стоп-кодона.

Ферменты и функции белкового синтеза
  • Пептидилтрансфераза является основным ферментом, используемым в трансляции. Он обнаружен в рибосомах с ферментативной активностью, которая катализирует образование ковалентной пептидной связи между соседними аминокислотами.
  • Активность фермента заключается в образовании пептидных связей между соседними аминокислотами с использованием тРНК во время трансляции.
  • Активность фермента использует два субстрата, один из которых имеет растущую пептидную цепь, а другой несет аминокислоту, которая добавляется к цепи.
  • Он расположен в большой субъединице рибосом, и поэтому основная функция пептидилтрансферазы заключается в катализе добавления аминокислотных остатков, обеспечивающих рост полипептидной цепи.
  • Фермент пептидилтрансфераза полностью состоит из РНК, и его механизм опосредован рибосомной РНК (рРНК), которая представляет собой рибозим, состоящий из рибонуклеотидов.
  • У прокариот субъединица 23S содержит пептидилтрансферазу между А-сайтом и О-сайтом тРНК, а у эукариот она находится в субъединице 28S.

Обзор синтеза белка
  • Рибосомная трансляция инициируется, когда рибосомы распознают начальную точку мРНК, где она связывает молекулу тРНК, содержащую одну аминокислоту.
  • У прокариот начальная аминокислота в N-формилметионине. при удлинении вторая аминокислота соединяется с первой.
  • Затем рибосома меняет свое положение на мРНК и повторяет цикл элонгации.
  • Когда процесс удлинения достигает стоп-кодона, цепь аминокислот спонтанно сворачивается, образуя белок.
  • Затем рибосомы разделяются на две субъединицы, но позже воссоединяются перед трансляцией другой мРНК.
  • Синтезу белка способствуют несколько каталитических белков, включая факторы инициации, элонгации, терминации и гуанозинтрифосфаты (ГТФ).
  • GTP представляет собой молекулу, которая высвобождает энергию при преобразовании в гуанозиндифосфат (GDP).
Изображение создано с помощью biorender.com

Стадии синтеза белка / Процесс в деталях

Инициация трансляции
  • Инициация синтеза белка запускается присутствием нескольких факторов инициации IF1, IF2 и IF2, и , тРНК.
  • Малая субъединица связывается с восходящим потоком на 5′-конце в начале мРНК. Рибосома сканирует мРНК в направлении от 5′ к 3′, пока не встретит стартовый кодон (AUG, GUG или UUG). Когда присутствует любой из этих стартовых кодонов, он распознается инициатором fMet-tRNA (N-formylMet-tRNA). Этот инициирующий фактор несет метионин (Met), который связывается с P-сайтом рибосомы.
  • Синтезирует первый аминокислотный полипептид, известный как N-формилметионин. Инициатор fMet-тРНК имеет нормальный метиониновый антикодон, поэтому он вставляет N-формилметионин.Это означает, что метионин является первой аминокислотой, которая добавляется и появляется в цепи.
  • Как правило, процесс инициации перевода состоит из трех этапов;
  1. Инициация связывания мРНК с малой субъединицей рибосомы (30S), стимулируя инициирующий фактор IF3. это диссоциирует рибосомные субъединицы на две.
  2. Фактор инициатора IF2 затем связывается с гуанинтрифосфатом (GTP) и с инициатором fMet-тРНК в P-сайте рибосом.
  3. Рибосомный белок расщепляет GTP, связанный с IF2, тем самым способствуя сборке двух рибосомных субъединиц. Выпускаются IF3 и IF2.

Рисунок: Схема этапов трансляции (синтез белка).

Удлинение трансляции
  • Удлинению синтеза белка способствуют три белковых фактора, т.е. EF-Tu, EF-Ts и EF-G .
  • Известно, что рибосомальная функция сдвигает один кодон за раз, катализируя процессы, происходящие в трех ее участках.
  • На каждом этапе заряженная тРНК входит в рибосомный комплекс и встраивает полипептиды, которые становятся на одну аминокислоту длиннее, а незаряженная тРНК уходит. У прокариот аминокислота добавляется как минимум каждые 0,05 секунды, а это означает, что около 200 полипептидных аминокислот транслируются за 10 секунд.
  • Связь между каждой аминокислотой происходит от гуанозинтрифосфата (ГТФ), который аналогичен аденозинтрифосфату (АТФ).
  • Все три сайта (A, P, E) участвуют в процессе трансляции, а сама рибосома взаимодействует со всеми типами РНК, участвующими в трансляции.
  • Таким образом, перевод включает в себя три отдельных этапа:
  1. Опосредование фактора элонгации-Tu (EF-Tu) при поступлении амино-ацил-тРНК в сайт А. Это влечет за собой связывание EF-Tu с GTP, что активирует комплекс EF-Tu-GTP для связывания с тРНК. Затем GTP гидролизуется до GDP, высвобождая молекулу фосфата, дающую энергию, что приводит к связыванию аминоацил-тРНК с сайтом A. В этот момент EF-Tu высвобождается, оставляя тРНК в А-сайте.
  2. Фактор элонгации EF-Ts затем опосредует высвобождение комплекса EF-Tu-GDP из рибосом и образование EF-Tu-GTP.
  3. Во время этого процесса транслокации полипептидная цепь пептидил-тРНК переносится на аминоацил-тРНК в А-сайте во время реакции, катализируемой пептидилтрансферазой. Затем рибосомы перемещаются на один кодон дальше по мРНК в направлении от 5′ к 3′, опосредованному фактором элонгации EF-G. Этот шаг черпает энергию из разделения GTP на GDP.Незаряженная тРНК высвобождается из Р-сайта, перенося вновь образованную пептидил-тРНК из А-сайта в Р-сайт.

Прекращение трансляции
  • Прекращение процесса трансляции инициируется встречей с любым из трех стоп-кодонов (UAA, UAG, UGA). Однако эти триплетные стоп-кодоны распознаются не тРНК, а белковыми факторами, известными как факторы высвобождения (RF1 и RF2) , обнаруженными в рибосомах.
  • RF1 распознает тройку UAA и UAG, а RF2 распознает UAA и UGA.Третий фактор также помогает катализировать процесс прекращения и известен как фактор высвобождения 3 (RF3).
  • Когда пептидил-тРНК со стадии элонгации достигает P-сайта, фактор высвобождения стоп-кодона связывается с A-сайтом. Это высвобождает полипептид из P-сайта, позволяя рибосомам диссоциировать на две субъединицы за счет энергии, полученной от GTP, оставляя мРНК.
  • После того, как многие рибосомы завершили процесс трансляции, мРНК расщепляется, позволяя повторно использовать ее нуклеотиды в других реакциях транскрипции.

белок синтез видео анимация (сестры Amoeba)

Eukaryotes синтез белка против прокариот синтез белка
8
S.n.

1 Eukaryotes

1 Прокариот

19
1. МРНК для перевода является моноцизором, кодирование для одного гена полипептидов МРНК для перевода представляет собой полицистронировать, таким образом, кодирующую для нескольких генов полипептидов
2. Три типа РНК-полимеразы используются для синтеза клеточной РНК.  Один тип РНК-полимеразы используется для контроля синтеза типов молекул РНК
3. Он включает обе субъединицы рибосом i. e 40S и 60S субъединицы. В нем участвуют 70S рибосомы
4. Транскрипция и трансляция происходят отдельно, поэтому они не перекрываются. Транскрипция и трансляция могут перекрываться
5. Пре-мРНК или мРНК перед трансляцией подвергаются модификации. мРНК не подвергается какой-либо модификации перед трансляцией.
6. У них есть специальный инициаторный комплекс тРНК. Используется специальный инициатор тРНК Met-tRNA f или Met – тРНК.
7. Исходной аминокислотой является метионин. Исходной аминокислотой является N-формилметионин
8. Имеют один сайт инициации и окончания. У них есть несколько мест начала и окончания.
9. Сайт связывания рибосом представляет собой последовательность Козака, которая сосредоточена вокруг инициирующего кодона.
10. Несколько инициирующих факторов участвуют в инициации синтеза полипептидной цепи i.e eIF-2, (eIF-2, eIF-2al, eIF-a2, eIF-a Включает три инициирующих фактора IF-1, IF-2 и IF-3.
11. Есть два фактора удлинения цепи, EF-1 и EF-2 Существует три фактора удлинения цепи, EF-Tu, EF-Ts и EP-G
12. Существует один фактор высвобождения eRF для распознавания трех кодонов терминации (UAA, UAG и UGA) Существует три фактора высвобождения (RF-1 или RF-2 и RF-3) для распознавания кодонов терминации.
13. Генетический код может различаться в митохондриях и хлоропластах. Генетический код одинаков во всех прокариотических организмах.

Ингибиторы синтеза белков

В качестве ингибиторов синтеза белков используются противомикробные средства, к которым относятся: Этот антибиотик ингибирует синтез белка, высвобождая цепи прокариотических полипептидов до того, как они полностью синтезируются.Его механизм достигается присоединением его аминогруппы к карбонильной группе растущей полипептидной цепи на А-сайте с образованием аддукта, который диссоциирует от рибосомы.

  • Пуромицин также содержит α-аминогруппу, подобную группе аминоацил-тРНК, которая образует ковалентно связанную пептидную связь с карбоксильной группой растущего пептида с остатками пуромицина, таким образом способствуя диссоциации рибосом.
  • Стрептомицин
    • Это трисахарид, который влияет на активность связывания формилметионил-тРНК с рибосомами.Это препятствует правильному запуску синтеза белка.
  • Аминогликозидные антибиотики, такие как неомицин, канамицин и гентамицин, которые мешают сайту декодирования в 16s рРНК малой субъединицы.
  • Хлорамфеникол ингибирует активность пептидилтрансферазы.
  • Эритромицин блокирует транслокацию путем связывания с субъединицей 50S
  • Циклогексимид используется для блокирования пептидилтрансферазы в эукариотических рибосомах и используется в качестве лабораторного инструмента для блокирования синтеза белка в эукариотических клетках.
  • Дифтерийный токсин содержит фрагмент А, который катализирует перенос одной боковой цепи EF2, который блокирует транслокацию растущей полипептидной цепи.
  • Ссылки и источники
    • Microbiology by Prescott, 5th Edition
    • 2% 15520
    • 1% – https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21424/
    • 1% – https://www.cell.com/cell/pdf/0092-8674(89)
    • -9.pdf
    • 1% – https://en.wikipedia.org/wiki/Peptidyl_transferase
    • 1% – https://bio.libretexts. орг / LibreTexts / University_of_California_Davis / BIS_2A% 3A_Introductory_Biology_ (Facciotti) / чтения / SS1_2018_Lecture_Readings / SS1_2018_Lecture_11
    • 1% — https://bio.libretexts.org/Courses/University_of_California_Davis/BIS_2A_(2018)%3A_Introductory_Biology_(Singer)/MASTER_RESOURCES/Translation %E2%80%94Protein_Synthesis*%23
    • 1% – https://bio.libretexts.org/Bookshelves/Microbiology/Book%3A_Microbiology_(Boundless)/4%3A_Cell_Structure_of_Bacteria%2C_Archaea%2C_and_Eukaryotes/4.6%3A_Specialized_Internal_Structures_of_Prokaryotes/4.6A%3A_Ribosomes
    • 1% — http://globalhealthprimer.emory.edu/targets-technologies/ белок-синтез.html
    • <1% – https://www.thoughtco.com/protein-synchronous-translation-373400
    • <1% – https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/хлорамфеникол
    • <1% — https://www.sciencedirect.com/topics/agriculture-and-biological-sciences/ribosomes
    • <1% – https://www.sciencedirect.com/topics/agriculture-and-biological-sciences/diphtheria-toxin
    • <1% – https://www.sciencedaily.com/terms/peptide_bond.htm
    • <1% – https://www.researchgate.net/publication/5558253_Inhibition_of_Helicobacter_pylori_Aminoacyl-tRNA_Amidotransferase_by_Puromycin_Analogues
    • <1%archgate – https://www.researchgate net/publication/11483240_Analysis_of_tryptophanase_operon_expression_in_vitro_-_Accumulation_of_TnaC-пептидил-тРНК_in_a_release_factor_2-depleted_S-30_extract_prevents_Rho_factor_action_simulating_induction
    • <1% – https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4749135/
    • <1% – https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4307249/
    • <1% – https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3919579/
    • <1% – https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3323968/
    • <1% – https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2919715/
    • <1% – https://www.nature.com/articles/s41389-018-0044-8
    • <1% – https ://www.cram.com/flashcards/mcat-biology-flashcards-1253204
    • <1% – https://www.biologydiscussion.com/rna/rna-ribonucleic-acid-chemical-nature-types-and-rna-world/15450
    • <1% – https://www.answers.com/Q/What_is_the_anticodon_for_methionine
    • <1% – https://www.annualreviews.org/doi/full/10.1146/annurev.biochem.72.110601.135450
    • <1% – https://wikimili.com/en/Peptidyl_transferase
    • <1% – https:// training.ncl.ac.uk/bms/wiki/index.php/Translation
    • <1% – https://quizlet.com/77160525/genetics-unit-iv-ch-12-from-p322-on-ch -13-и-ч-15-флеш-карт/
    • <1% – https://quizlet.com/477610163/biochemistry-ch-7-flash-cards/
    • <1% – https://quizlet.com/291704106/genetics-chapter-13-usf-flash-cards/
    • <1% – https: //quizlet.com/20669105/chapter-13-translation-flash-cards/
    • <1% – https://pediaa.com/difference-between-mrna-and-trna-and-rrna/
    • <1 % – https://microbenotes.com/rna-polymerase/
    • <1% – https://flexbooks.ck12.org/cbook/ck-12-biology-flexbook-2.0/section/4.7/primary/lesson/ трансляция-РНК-в-белок-био/
    • <1% – https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/j.1432-1033.1983.tb07643.x
    • <1% – https://en.wikipedia.org/wiki/Peptidyl-tRNA
    • <1% – https: //en.wikipedia.org/wiki/MRNA
    • <1% – https://en.wikipedia.org/wiki/EF-Tu
    • <1% – https://ecampusontario.pressbooks.pub/microbio/ глава/белковый-синтез-перевод/
    • <1% – https://barbadosunderground.files.wordpress.com/2015/03/antimicrobial-drugs-a-fading-miracle.pdf
    • <1% – https:/ /ответы.yahoo.com/question/index?qid=20070613182552AAYieJn
    • <1% – http://thebiologyprimer.com/transcription-rna-processing-and-translation

    Трансляция мРНК в белок: этапы инициации, элонгации и терминации — Видео и стенограмма урока

    Посвящение

    В инициации мРНК присоединяется к тРНК, которая присоединяется к указанной аминокислоте.

    Начнем с посвящения .Во время инициации мРНК, тРНК и первая аминокислота объединяются в рибосоме. Нить мРНК остается непрерывной, но истинной точкой инициации является стартовый кодон AUG. Помните, что стартовый кодон — это набор из трех нуклеотидов, с которых начинается закодированная последовательность гена. Помните также, что стартовый кодон определяет аминокислоту метионин. Итак, метионин — это название аминокислоты, которая вводится в рибосому первой.

    И как метионин попал на рибосому? Присоединяясь к тРНК, содержащей нужный антикодон.Антикодон для AUG — UAC. Мы знаем это из-за правил комплементарного спаривания оснований. ТРНК с антикодоном UAC автоматически совпадет с кодоном AUG, а вместе с ним и метионин. Итак, вот оно: мРНК присоединена к тРНК, а тРНК присоединена к метионину. Это инициация.

    Удлинение

    Следующий шаг составляет основную часть перевода. Это называется удлинением и представляет собой присоединение аминокислот путем образования пептидных связей.Удлинение — это то, на что это похоже: цепь аминокислот становится все длиннее и длиннее по мере добавления большего количества аминокислот. Это в конечном итоге создаст полипептид.

    Теперь, когда мы начали со стартового кодона, мРНК немного смещается через рибосому, так что следующий кодон доступен для захвата. Допустим, следующий кодон — UAU. Итак, теперь нам нужна тРНК с соответствующим антикодоном AUA. О, смотри! Вот тРНК с нужным антикодоном, и она содержит тирозин. Тирозин представляет собой аминокислоту, определяемую кодоном UAU.ТРНК присоединяется к мРНК в рибосоме и выстраивает тирозин рядом с ожидающим метионином. Между двумя аминокислотами образуется пептидная связь.

    Затем первая тРНК оставляет позади всех остальных и уплывает в поисках дополнительной работы. Бедный метионин! Теперь он просто дрейфует, как одинокий воздушный змей на ветру! Эта тРНК оставила метионин висеть только на одном якоре: его пептидной связи с тирозином. Тирозин все еще связан со своей собственной тРНК, которая, в свою очередь, цепляется за мРНК внутри рибосомы.Мы уже можем видеть зачатки полипептида, удлиняющегося наружу.

    Полипептиды образуются по мере добавления аминокислот на этапе удлинения.

    Должны ли мы повторить этот процесс еще раз? Давайте оставим все как есть и добавим нашу третью аминокислоту. мРНК снова смещается, и теперь третий кодон готов к совпадению. Что это за кодон? САС. Вот тРНК с соответствующим антикодоном GUG.Это также принесло нам гистидин, так как CAC кодирует гистидин. Антикодон тРНК совпадает с кодоном мРНК, что ставит гистидин в идеальное положение для образования пептидной связи с тирозином.

    Итак, теперь у нас есть связанные метионин, тирозин и гистидин. Нам больше не понадобится тирозиновая тРНК, так что тРНК отделится и уплывет, как первая в начале. Теперь у нас есть еще более длинный воздушный змей; метионин и тирозин дрейфуют, удерживая их на рибосоме только своими пептидными связями.

    Но гистидин по-прежнему связан со своей собственной тРНК, и он останется таким до тех пор, пока не найдется следующая аминокислота, за которую можно будет зацепиться. Вы можете видеть, как эта цепочка аминокислот будет удлиняться по мере трансляции каждого нового кодона. Процесс присоединения и образования пептидной связи продолжается снова и снова, пока цепь не станет длиной около ста аминокислот.

    Терминация

    Цепь окончательно заканчивается, когда стоп-кодон перемещается в рибосому. Это последний этап трансляции, называемый завершением .Терминация начинается с прихода одного из трех стоп-кодонов: UAA, UAG или UGA. Когда любой из них входит в рибосому, последняя аминокислота отрезает свой якорь от последней тРНК. ТРНК и рибосома больше не нужны. Ген успешно транслировался, и теперь у нас есть готовый полипептид.

    При терминации стоп-кодон сигнализирует об окончании синтеза полипептида.

    Полипептид, наконец, свободен — он может счастливо дрейфовать по всей цитоплазме, не связанный ковалентными связями! Этот последний этап, терминация, является окончанием синтеза полипептида, о чем сигнализирует стоп-кодон, входящий в рибосому.

    Значит ли это, что мы, наконец, построили белок? Нет, но мы построили полипептид. Часто для построения белка требуется более одного полипептида. Помните, что синтез белка — это отдельный от трансляции процесс. Итак, только потому, что вы создали полипептид, не означает, что вы создали белок.

    Роль рибосомных участков в трансляции

    Когда мы говорим о процессе трансляции генетического материала с ДНК на РНК и на полноценный белок, важно помнить о роли, которую играют сами рибосомы в фазах инициации, элонгации и прекращение.Рибосомы состоят из двух субъединиц, одной большой и одной маленькой. На рибосоме расположены четыре участка. Один из этих сайтов предназначен для мРНК, а три на большой субъединице рибосомы — для тРНК. Эти три сайта тРНК называются сайтами Р, А и Е.

    Во время инициации инициирующая тРНК находится в месте связывания рибосомы, называемом Р-сайтом. Второй сайт связывания рибосомы, называемый А-сайтом, в этот момент открыт. Однако, когда новая молекула тРНК распознает следующие направления кодонов в последовательности мРНК, эта новая тРНК присоединяется к этому открытому сайту А.Затем аминокислота тРНК в Р-сайте и аминокислота тРНК в А-сайте соединяются пептидной связью.

    По мере движения рибосомы вдоль молекулы мРНК происходит удлинение цепи. ТРНК в Р-сайте высвобождается, а тРНК в А-сайте перемещается в Р-сайт. В этот момент сайт А снова свободен и готов к присоединению другой тРНК с новыми инструкциями кодона от мРНК. Этот процесс продолжается до тех пор, пока не образуется длинная белковая цепь.

    Наконец, в фазе терминации рибосома достигает кодона терминации мРНК. Сайт E на рибосоме является сайтом выхода, и в этот момент, после потери аминокислоты, рибосома высвобождает последнюю тРНК. Затем новая белковая цепь подвергается любым модификациям, необходимым для того, чтобы она функционировала должным образом.

    Итоги урока

    Теперь, когда мы рассмотрели все детали перевода, мы можем дать ему более конкретное определение. Можно сказать, что: трансляция — это синтез полипептида с использованием генетического кода, содержащегося в мРНК.Это все еще вписывается в наши самые ранние наброски центральной догмы. Трансляция — это механизм, с помощью которого информация в РНК трансформируется в белок. В этом уроке мы изучили три шага перевода. Давайте вернемся и убедимся, что все они у нас получились красивыми и четкими.

    Инициация трансляции происходит, когда мРНК, тРНК и аминокислота встречаются внутри рибосомы. Как только трансляция началась, она продолжается по линии по мере того, как мРНК перемещается по рибосоме.Каждый новый кодон соответствует новому антикодону тРНК, внося новую аминокислоту для удлинения цепи. Во время элонгации аминокислоты постоянно добавляются к линии, образуя длинную цепь, связанную вместе пептидными связями.

    Как только стоп-кодон достигает рибосомы, трансляция останавливается или завершается. При терминации полипептид освобождается от рибосомы, и тРНК перестают вносить аминокислоты. Все компоненты отделяются друг от друга, и осуществляется трансляция.В результате получается совершенно новый свободно плавающий полипептид.

    Результат обучения

    Следуя этому видео, вы сможете описать каждый из трех этапов трансляции: инициацию, удлинение и завершение.

    Гетеродимеризация DENR-MCTS1 и рекрутирование тРНК необходимы для повторной инициации трансляции

    Abstract

    Последовательность молекулярных событий, приводящая к повторной инициации эукариотической трансляции, когда рибосомы прекращают трансляцию короткой открытой рамки считывания (ORF), возобновляют сканирование и затем транслируют вторую ORF на той же мРНК, изучена недостаточно.Регулируемый плотностью фактор повторной инициации и высвобождения (DENR) и множественные копии при Т-клеточной лимфоме-1 (MCTS1) участвуют в стимулировании повторной инициации трансляции как in vitro в трансляционных экстрактах, так и in vivo. Мы представляем здесь кристаллическую структуру MCTS1, связанного с фрагментом DENR. Основываясь на этой структуре, мы идентифицируем и экспериментально подтверждаем, что остатки DENR Glu42, Tyr43 и Tyr46 важны для связывания MCTS1, а остаток Phe104 MCTS1 важен для связывания тРНК. Мутация этих остатков показывает, что димеризация DENR-MCTS1 и связывание тРНК необходимы для того, чтобы DENR и MCTS1 способствовали повторной инициации трансляции в клетках человека.Таким образом, эти данные связывают отдельные остатки DENR и MCTS1 со специфическими молекулярными функциями комплекса. Поскольку DENR-MCTS1 может связывать тРНК в отсутствие рибосомы, это предполагает, что комплекс DENR-MCTS1 может рекрутировать тРНК на рибосому во время повторной инициации аналогично комплексу эукариотического фактора инициации 2 (eIF2) в кэп-зависимой трансляции.

    Резюме автора

    Обычно эукариотические рибосомы транслируют только одну открытую рамку считывания (ORF) на мРНК, а затем диссоциируют от мРНК.В некоторых случаях, когда имеется короткая восходящая открытая рамка считывания (uORF), которая предшествует основной ORF, рибосомы могут транслировать uORF, завершать трансляцию, а затем подвергаться плохо понимаемому процессу, называемому «повторной инициацией трансляции», посредством чего они возобновляют сканирование в поисках другой AUG. кодона инициации, а затем транслировать основную ORF. Молекулярные функции, необходимые для повторной инициации трансляции, неизвестны. Ранее мы показали, что в этом процессе участвуют два неканонических фактора инициации, фактор повторной инициации и высвобождения, регулируемый плотностью (DENR), и множественные копии при Т-клеточной лимфоме-1 (MCTS1).Здесь мы показываем, основываясь на структуре MCTS1, связанного с фрагментом DENR, что для того, чтобы успешно способствовать повторной инициации трансляции, DENR и MCTS1 необходимо димеризоваться, и им необходимо связывать тРНК. Таким образом, мы идентифицируем две молекулярные функции, необходимые для повторной инициации трансляции.

    Образец цитирования: Ahmed YL, Schleich S, Bohlen J, Mandel N, Simon B, Sinning I, et al. (2018) Гетеродимеризация DENR-MCTS1 и рекрутирование тРНК необходимы для повторной инициации трансляции. PLoS Биол 16(6): е2005160.https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2005160

    Академический редактор: Венди Гилберт, Йельский университет, США

    Получено: 18 декабря 2017 г.; Принято: 23 мая 2018 г .; Опубликовано: 11 июня 2018 г.

    Авторское право: © 2018 Ahmed et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Доступность данных: Координаты и структурные факторы были депонированы в банк данных белков под кодом доступа: 5ONS. Числовые данные, лежащие в основе графиков фигур, находятся в данных S1.

    Финансирование: Deutsche Forschungsgemeinschaft (номер гранта TE 766/7-1). получил ААТ. Спонсор не участвовал в разработке дизайна исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Deutsche Forschungsgemeinschaft (номер гранта SFB1036).получено IS и AAT. Спонсор не участвовал в разработке дизайна исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Программа Лейбница (номер гранта SI 586/6-1). получил ИС. Спонсор не участвовал в разработке дизайна исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. DKFZ NCT3.0 Интегративный проект по исследованию рака (номер гранта NCT3.0_2015.54 DysregPT). получил ААТ. Спонсор не участвовал в разработке дизайна исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.Сотовые сети. AAT и IS являются исследователями Кластера передового опыта: CellNetworks. Спонсор не участвовал в разработке дизайна исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Сокращения: аа, аминокислота; CDK4, циклинзависимая киназа 4; ДЭНР, регулируемый плотностью фактор повторной инициации и высвобождения; ДУФ1947, домен неизвестной функции 1947; eIF1, эукариотический фактор инициации 1; eIF2, эукариотический фактор инициации 2; eIF2D, эукариотический фактор инициации 2D; eIF3, эукариотический фактор инициации 3; eIF4F, эукариотический фактор инициации 4F; ГТУ, гуанозинтрифосфат; ЕГО, полигистидин; ИРЭС, внутренний сайт входа в рибосому; МЦТС1, множественные копии при Т-клеточной лимфоме-1; МДМ2, мышь двойная минута 2; ОРФ, открытая рамка чтения; ПАР, 4-(2-пиридилазо)резорцин; ПОС, прединициативный комплекс; ПУА, псевдоуридинсинтаза и археозинтрансгликозилаза; СКО, среднеквадратичное отклонение; ПЕЧАЛЬНЫЙ, одноволновая аномальная дисперсия; миРНК, малая интерферирующая РНК; стуОРФ, восходящая открытая рамка считывания с сильным контекстом инициации; СУИ1, супрессоры мутаций инициирующего кодона 1; СВ40, обезьяний вирус 40; СВИБ, SWIch /Сахароза Неферментируемый комплекс B; ТГТ, тРНК-гуанинтрансгликозилаза; uORF, открытая рамка считывания восходящего потока; вт, крылатая спираль; ВТ, дикого типа; РФА, Рентгенофлуоресцентный

    Введение

    Эукариотическая реинициация трансляции — это процесс, который только недавно стал пониматься на механистическом и функциональном уровнях.В отличие от прокариотических рибосом, считалось, что эукариотические рибосомы участвуют в основном в одном раунде инициации, удлинения и терминации отдельной мРНК. После рекрутирования рибосомной 40S-субъединицы на мРНК, часто через 5′-кэп, 40S сканирует, чтобы найти первый подходящий стартовый кодон AUG для присоединения 60S-субъединицы и начала трансляции. После трансляции этой открытой рамки считывания (ORF) и терминации субъединица 60S диссоциирует от мРНК, оставляя субъединицу 40S связанной с мРНК.В большинстве случаев субъединица 40S затем также диссоциирует от мРНК, оставляя нетранслируемыми дополнительные расположенные ниже ORF на мРНК. Однако, когда транслируемая ORF короткая, как в случае многих вышележащих открытых рамок считывания (uORF), 40S может оставаться связанной с мРНК, возобновлять сканирование и повторно инициировать трансляцию в нижестоящей ORF [1]. В самом деле, недавние исследования профилирования рибосом обнаружили повсеместную трансляцию uORF [2-4], указывая на то, что во многих из этих случаев повторная инициация трансляции важна для обеспечения трансляции основной ORF на мРНК.

    Как стандартная инициация трансляции, зависящая от ограничения, так и повторная инициация трансляции состоят из последовательности событий, которые тщательно организованы, чтобы привести к инициации трансляции. В случае кэп-зависимой трансляции это было тщательно изучено и, как известно, включает рекрутирование тРНК через тройной комплекс на малую рибосомную субъединицу, дающую 43S преинициаторный комплекс (PIC), и последующее рекрутирование этого комплекса на мРНК. cap через комплекс эукариотического фактора инициации 4F (eIF4F).Однако в случае повторной инициации трансляции последовательность событий еще не ясна. В частности, неизвестно, какие факторы ответственны за рекрутирование новой инициаторной тРНК на рибосому и как это происходит.

    На ускорение процесса повторной инициации влияют несколько факторов. Одним из таких факторов является эукариотический фактор инициации 3 (eIF3), который остается ассоциированным с рибосомами после терминации на коротких uORF [5]. Недавняя работа также вовлекла фактор реинициации и высвобождения, регулируемый плотностью белков (DENR), множественные копии в Т-клеточной лимфоме-1 (MCTS1) и эукариотический фактор инициации 2D (eIF2D) в реинициации [6-10].MCTS1 впервые был идентифицирован как ген, который амплифицируется на геномном уровне при Т-клеточных лейкозах [11]. Последующие исследования показали, что уровни белка MCTS1 также повышены в линиях Т-клеточных лимфоидных клеток, в клеточных линиях неходжкинской лимфомы и в 85% первичных диффузных крупноклеточных В-клеточных лимфом [12]. Функциональные исследования, в основном проведенные в лаборатории Gartenhaus, показали, что MCTS1 обладает онкогенными свойствами. MCTS1 способствует независимому от привязки росту клеток NIh4T3 и MCF-10A [11,13], а его сверхэкспрессия ускоряет клеточный цикл, укорачивая G1 и повышая активность циклина D1 и циклинзависимой киназы 4 (Cdk4) [14].Белок DENR связывается с MCTS1 [15] и сверхэкспрессируется в клетках рака молочной железы [16]. eIF2D представляет собой более крупный белок, который имеет гомологию последовательности с MCTS1 в его N-концевой половине и с DENR в его C-концевой половине (рис. 1A), и функциональные исследования предполагают, что он сочетает в себе активность MCTS1 и DENR [6,7]. Для повторной инициации трансляции рибосомам необходимо повторно приобрести инициаторную тРНК. Было обнаружено, что eIF2D или комбинация DENR-MCTS1 способствуют эукариотическому независимому от фактора инициации 2 (eIF2) и независимому от гуанозинтрифосфата (GTP) рекрутированию комплексов Met-tRNA i Met с 40S, если кодон инициации расположен в P-сайт 40S, как в случае с вирусоподобными внутренними сайтами входа рибосом (IRES) вируса гепатита С [6,7].Действительно, было показано, что eIF2D способствует повторной инициации трансляции при добавлении в восстановленные in vitro системы [8,9]. Недавно мы показали, что DENR и MCTS1 (также известный как MCT-1) способствуют повторной инициации трансляции на клеточных мРНК Drosophila и в клетках человека [10,17].

    Рис. 1. Структура MCTS1 с высоким разрешением, связывающая N-концевой фрагмент DENR.

    (A) Архитектура домена DENR, MCTS1 и родственного белка eIF2D (лигатин). (B) Серия усечений DENR идентифицирует aas 24–51 DENR как минимальный пептид, способный связывать MCTS1 в Escherichia coli .Сводка данных, представленных на S1 Рис. (C) Кристаллическая структура минимального комплекса DENR-MCTS1. MCTS1 содержит N-концевой домен DUF1947 (светло-зеленый) и С-концевой домен PUA (зеленый). Пептид DENR (светло-оранжевый) связывается вдоль поверхности раздела между N- и C-концевыми доменами MCTS1. Аномальная плотность (14σ), рассчитанная с помощью ANODE, показана в виде сетки. (D) DENR содержит цинковый палец на N-конце, состоящий из Cys34, 37 и 44. Хотя в нашей конструкции DENR отсутствует четвертый остаток (Cys53) для завершения координации Zn 2+ , цинковый палец правильно сложен , так как он дополняется His58 кристаллографически родственной молекулы MCTS1.аа, аминокислота; DENR, фактор повторного инициирования и высвобождения, регулируемый плотностью; DUF1947, домен с неизвестной функцией 1947 г.; eIF1, эукариотический фактор инициации 1; eIF2D, эукариотический фактор инициации 2D; MCTS1, множественные копии при Т-клеточной лимфоме-1; MDM2, двойная мышь на 2-й минуте; PUA, псевдоуридинсинтаза и археозинтрансгликозилаза; SUI1 – супрессоры мутаций инициирующего кодона 1; SWIB SWIch /Неферментируемый комплекс сахарозы B; WH, крылатая спираль

    https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2005160.g001

    Структура MCTS1 содержит укладку доменов псевдоуридинсинтазы и археозинтрансгликозилазы (PUA), обычно присутствующую в белках, связывающих РНК [26]. DENR содержит домен SUI1, аналогичный эукариотическому фактору инициации 1 (eIF1) [7]. Чтобы лучше понять структуру и функцию комплекса MCTS1-DENR, мы решили получить структуру MCTS1 с высоким разрешением, связанную с DENR. Здесь мы представляем кристаллическую структуру MCTS1 с разрешением 2,14 Å, связанную с N-концевым фрагментом DENR, которая дополняет две недавние структуры eIF2D или DENR-MCTS1 с низким разрешением, связанные с 40S рибосомной субъединицей [19,20].Наша структура идентифицирует специфические остатки на DENR и на MCTS1, важные для гетеродимеризации комплекса и для связывания тРНК соответственно. Мы обнаружили, что мутация этих остатков приводит к сильным функциональным нарушениям, снижая способность комплекса DENR-MCTS1 повторно инициировать трансляцию в клетках человека. Это показывает, что гетеродимеризация DENR-MCTS1 и связывание тРНК необходимы для этого комплекса, чтобы способствовать повторной инициации трансляции in vivo. Кроме того, мы обнаружили, что комплекс DENR-MCTS1 способен связывать тРНК в отсутствие рибосомы.Это указывает на то, что комплекс DENR-MCTS1 может сначала связывать тРНК, образуя тримерный комплекс, а затем рекрутировать ее на рибосому во время повторной инициации, аналогично комплексу eIF2 при кэп-зависимой трансляции.

    Результаты

    Идентификация минимального MCTS1-связывающего домена DENR

    MCTS1 и DENR гомологичны N- и С-концевым доменам eIF2D (также известного как лигатин) соответственно (рис. 1А) и связываются друг с другом in vivo [15]. Чтобы изучить интерфейс связывания между MCTS1 и DENR, мы сначала стремились идентифицировать часть DENR, ответственную за связывание MCTS1.Мы коэкспрессировали меченный полигистидином (HIS) MCTS1 с немеченым полноразмерным DENR в E . coli и обнаружили, что аффинная очистка HIS-MCTS1 также снижает DENR из лизатов бактериальных клеток (дорожки 1–7, рис. S1A). Используя этот анализ связывания и серию усечений DENR, мы идентифицировали аминокислоты DENR (aas) 24–51 как минимальную область для связывания MCTS1 (рис. 1B и рис. S1A-S1E).

    Кристаллическая структура минимального комплекса DENR–MCTS1

    В предыдущем исследовании сообщалось о кристаллической структуре MCTS1, содержащей три мутации (E137A, K139A и Q140A, далее именуемые MCTS1x), которые были разработаны для обеспечения возможности кристаллизации [18].Чтобы определить структуру DENR-MCTS1, мы попытались кристаллизовать полноразмерный гетеродимерный комплекс как с этими тремя мутациями, так и без них, но не получили кристаллов. Вместо этого мы собрали и кристаллизовали минимальный комплекс, состоящий из полноразмерного MCTS1 дикого типа (WT) и остатков 24–51 DENR, и определили его кристаллическую структуру с разрешением 2,14 Å (рис. 1C и 1D). Статистические данные по сбору и уточнению данных приведены в таблице 1. Асимметричная единица содержит один комплекс DENR-MCTS1, который, как было определено, содержит одну биологически значимую сборку вместо комплекса, удовлетворяющего координации ионов металлов (см. следующий абзац).Хотя первоначально мы определили структуру молекулярным замещением, сильная положительная плотность вблизи MCTS1-His58 и трех остатков Cys DENR предполагает присутствие иона металла, скорее всего, цинка. Поэтому мы собрали набор данных на краю Zn и смогли определить структуру de novo с помощью одноволновой аномальной дисперсии Zn (SAD). Идентичность цинка была подтверждена рентгенофлуоресцентным (XRF) анализом (S1F Fig) и колориметрическим анализом с использованием 4-(2-пиридилазо)резорцина (PAR) [21,22] (S1G Fig).Общая структура MCTS1 по существу такая же, как у ранее описанного варианта кристаллизации MCTS1x, на что указывает низкое среднеквадратичное отклонение (RMSD) 0,71 Å для 181 остатка (S1H Fig). N-конец DENR (остатки с 25 по 33) в значительной степени вытянут, лишен вторичной структуры, в то время как С-концевая часть содержит частичный цинковый палец (остатки с 34 по 44) и короткую α-спираль (остатки с 44 по 46), которые , согласно предсказанию вторичной структуры, будет простираться до остатка 60. Мы наложили нашу структуру на MCTS1 в недавно опубликованной структуре низкого разрешения комплекса 40S-DENR-MCTS1 [20].DENR-пептид из нашего гетеродимера хорошо вписывается в неназначенную электронную плотность вблизи домена MCTS1 PUA (рис. S1I). Плотность остатков 29–31 DENR не является непрерывной, что предполагает некоторую гибкость связывания. Напротив, плотность цинкового пальца очень хорошо определена, и на С-конце нашей конструкции видна дополнительная плотность, что согласуется с предсказанной α-спиралью.

    Примечательно, что цинковый палец не был предсказан в DENR. Частичный координационный сайт Zn 2+ включает Cys34, Cys37 и Cys44 и завершается в кристалло с помощью MCTS1-His58 кристаллографически родственной симметрии (рис. 1D).Мы проверили, опосредует ли MCTS1 His58 связывание MCTS1 с DENR, но это не так, потому что HIS-MCTS1 [H58A] все еще способен снижать DENR (рис. S2A-S2A). Мутантная форма DENR, которая не может связывать MCTS1 (DENR[RAA] описана в разделе «Результаты» «Для активности требуется димеризация DENR-MCTS1» ниже), все же способна связывать Zn 2+ (61% уровней WT), что указывает на что DENR не требует MCTS1 для координации Zn 2+ . DENR имеет четвертый цистеин в положении 53, который может завершить координацию Zn 2+ ; однако Cys53 отсутствует в нашей конструкции для кристаллизации.Испытания кристаллизации с конструкцией DENR, включающей Cys53 (остатки 24–55), не дали кристаллов. Однако мутация Cys53 в аланин почти не влияла на связывание Zn 2+ (рис. S1G). Вместе эти данные предполагают, что DENR координирует Zn 2+ в основном через три, а не четыре цистеина, что также наблюдается в других белках [23,24]. Ранее мы сообщали об открытии мутации de novo missense DENR Cys37 у пациента с расстройством аутистического спектра [25]. Наша структура теперь показывает, что Cys37 является частью этого цинкового пальца.Интересно, что этой единственной мутации достаточно, чтобы отменить связывание Zn 2+ комплексом DENR-MCTS1 (рис. S1G). Эта мутация сильно нарушает функцию DENR [25], предполагая, что конъюгация цинка необходима для правильного функционирования комплекса DENR-MCTS1. Эти остатки цистеина в DENR не сохраняются в eIF2D, что позволяет предположить, что координация Zn 2+ специфична для комплекса DENR-MCTS1.

    Димеризация DENR-MCTS1 требуется для активности

    N-конец DENR (остатки 25–33) разворачивается и ползет вдоль N-концевого домена неизвестной функции 1947 (DUF1947) MCTS1 (рис. 2А).Большинство остатков, участвующих в связывании DENR, консервативны, в частности, Leu82, Leu170 и Trp175 (S2B Fig), которые образуют гидрофобную поверхность. DENR в основном взаимодействует с MCTS1 через основную цепь, за исключением DENR-Tyr33, который образует водородные связи с MCTS1-His86. Разветвленная сеть водородных связей образуется между DENR-Glu42 и остовами MCTS1-Gln140 и His141, между DENR-Tyr43 и MCTS1-Lys139, между DENR-Tyr43 и карбонилом MCTS-His141, а также между DENR-Tyr46 и MCTS1. -Лис139.Хотя MCTS1-Lys139 является высококонсервативным, Gln140 и His141 вообще не консервативны, что согласуется с тем, что для взаимодействия требуется только пептидный остов (рис. S2B). В целом взаимодействие между MCTS1 и DENR покрывает поверхность 733,5 Å 2 и 834,9 Å 2 , что соответствует 7,8% и 33,6% общей доступной для растворителя поверхности на N-концевой области MCTS1 и DENR соответственно.

    Рис. 2. Связывание DENR-MCTS1 необходимо для функционирования комплекса.

    (A) Остатки, участвующие во взаимодействии между DENR и MCTS1. DENR-Glu42 взаимодействует с азотом основной цепи MCTS1-Gln140 и His141. Кроме того, DENR-Tyr43 и Tyr46 образуют водородные связи с MCTS1-His141 и Lys139 соответственно. (B) Мутация DENR E42, Y43 и Y46, но не любых двух из этих трех, отменяет связывание с MCTS1 в E . кишечная палочка . HIS-меченые варианты DENR коэкспрессировались в E . coli и очищали с помощью аффинной хроматографии для обнаружения соочищающего MCTS1 (представитель 4 биологических повторов).(C) Тройная мутация DENR E42R, Y43A, Y46A («RAA») отменяет связывание DENR с MCTS1 в клетках HeLa. Клетки HeLa трансфицировали для экспрессии DENR[WT] («WT»), DENR[RAA] («RAA») или ни того, ни другого («-»). Связывание DENR-MCTS1 анализировали путем иммунопреципитации вариантов DENR, меченных HA, и обнаружения копреципитации эндогенного MCTS1 с помощью иммуноблота, репрезентативного для 2 биологических повторов). (DD’) DENR должен связывать MCTS1, чтобы быть функционально активным. (D-D) Активность DENR[E42R, Y43A, Y46A] («RAA») оценивали путем восстановления клеток HeLa с нокдауном DENR путем повторной экспрессии («OE») либо WT, либо мутантного DENR.DENR[WT] и DENR[RAA] содержат синонимичные замены, чтобы избежать нокдауна, опосредованного siRNA. Активность оценивают как способность способствовать повторной инициации трансляции ниже stuORF, как сообщалось ранее [10] ( n = 3). (D”) Поскольку DENR[RAA] менее стабилен, чем DENR[WT] (см. рис. S2D), количество плазмиды со сверхэкспрессией DENR[RAA] было увеличено, чтобы получить по крайней мере такое же количество белка, как DENR[WT]. Здесь показаны уровни DENR из того же набора клеток, что и в (D’). Базовые данные доступны в S1 Data.ЦМВ, цитомегаловирус; DENR, фактор повторного инициирования и высвобождения, регулируемый плотностью; FLUC, люцифераза светлячков; HA, человеческий гемагглютинин гриппа; HIS, полигистидин; IP, иммунопреципитация; MCTS1, множественные копии при Т-клеточной лимфоме-1; RLUC, люцифераза Renilla; siRNA, малая интерферирующая РНК; stuORF, восходящая открытая рамка считывания с сильным контекстом инициации; SV40, обезьяний вирус 40; TEV, вирус травления табака; WT, дикий тип

    https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2005160.g002

    Чтобы оценить вклад DENR Glu42, Tyr43 и Tyr46 в связывание MCTS1, мы создали варианты DENR, в которых эти три остатка мутировали либо попарно, либо все три вместе. (E42R, Y43A и Y46A; далее DENR[RAA]).Хотя мутация любых двух из этих трех остатков не отменяет связывания между DENR и MCTS1 в E. coli , мутировавшие все три, заметно снижали способность DENR и MCTS1 связываться друг с другом (фиг. 2B и фиг. S2C). DENR[RAA] также был неспособен связывать MCTS1 в клетках HeLa, что определялось методом коиммунопреципитации (рис. 2C). Эти данные идентифицируют эту поверхность взаимодействия как релевантную для связывания DENR-MCTS1 и определяют Glu42, Tyr43 и Tyr46 как важные остатки для этого взаимодействия.

    Ранее мы использовали репортер люциферазы, несущий очень короткую открытую рамку считывания вверх по течению с сильным контекстом инициации (stuORF) в качестве считывания способности DENR-MCTS1 способствовать повторной инициации трансляции in vivo (рис. 2D) [10,17,25]. . Это показало, что и DENR, и MCTS1 необходимы для эффективной повторной инициации трансляции. Поскольку DENR и MCTS1 связываются друг с другом, мы затем спросили, важна ли способность образовывать гетеродимер для их функции. Мы лишили клетки HeLa эндогенного DENR с помощью малых интерферирующих РНК (siRNAs), мы восстановили клетки либо с DENR[WT], либо с DENR[RAA] с использованием конструкций, которые избегают нокдауна, опосредованного siRNA, а затем мы проанализировали активность реинициации с использованием конструкции stuORF. Рис. 2D–2D»).Выполняя эти эксперименты по восстановлению, мы обнаружили, что DENR[RAA] экспрессируется хуже, чем DENR[WT] (рис. S2D). Следовательно, для экспериментов по восстановлению мы увеличили количество экспрессионной плазмиды DENR[RAA] по сравнению с плазмидой DENR[WT], чтобы иметь как минимум столько же белка DENR[RAA], сколько белка DENR[WT] (рис. 2D»). ). Тем не менее, способность DENR[RAA] способствовать повторной инициации трансляции была значительно снижена по сравнению с белком дикого типа: как сообщалось ранее, нокдаун DENR вызывает снижение активности репортера stuORF по сравнению с контрольным репортером, лишенным stuORF (вторая группа столбцов, рис. 2D’).Реэкспрессия DENR[WT] восстанавливает репортерную активность stuORF (третий набор столбцов, рис. 2D’). Напротив, DENR[RAA] нарушена в обеспечении активности репортера stuORF (четвертый набор столбцов, Fig 2D’), что указывает на то, что гетеродимеризация комплекса DENR-MCTS1 важна для его активности в реинициации трансляции.

    DENR-MCTS1 связывает тРНК in vitro в отсутствие рибосом

    MCTS1 содержит домен PUA, который часто встречается в тРНК-связывающих белках [26]. Действительно, родственный белок eIF2D способен способствовать привлечению Met-tRNA i Met к рибосомной 40S субъединице [6,7].Более того, предполагается, что DENR и MCTS1 находятся в непосредственной близости от тРНК, когда структуры DENR и MCTS1, связанные с 40S субъединицей рибосомы, накладываются на структуру PIC, содержащую тРНК и Met [20]. Однако, насколько нам известно, прямое связывание DENR-MCTS1 с тРНК еще не было продемонстрировано in vitro. Чтобы изучить, связывает ли DENR-MCTS1 тРНК, мы очистили рекомбинантный полноразмерный DENR, MCTS1 или коэкспрессированный комплекс DENR-MCTS1 из E . coli и провели анализ сдвига геля с дрожжевой тРНК (фиг. S3A). В отличие от одного MCTS1 или одного DENR, которые демонстрировали небольшую способность к связыванию тРНК или вообще не проявляли ее, комплекс DENR-MCTS1 был способен значительно замедлять подвижность тРНК (рис. S3A). В соответствии с тем, что DENR и MCTS1 нуждаются в гетеродимеризации для связывания тРНК, мутант DENR[RAA], который не способен связывать MCTS1, также не сдвигал тРНК (S3B Fig). Интересно, что мы наблюдали значительно притупленную способность связывания тРНК, когда MCTS1 и DENR были очищены отдельно от бактерий, а затем смешаны вместе in vitro («DENR+MCTS1», S3A Fig), что повышает вероятность того, что комплекс должен образовываться in vivo, чтобы быть функциональным.На связывание DENR-MCTS1 с тРНК не оказывали сильного влияния концентрации соли до 500 мМ (рис. S3C). Затем мы спросили, обладает ли комплекс DENR-MCTS1 разной аффинностью связывания с разными тРНК. Анализы связывания с тремя различными тРНК дрожжей показали, что комплекс DENR-MCTS1 связывает iMet-тРНК и Lys-тРНК с большей готовностью, чем Cys-тРНК, и что на связывание тРНК не влияет состояние ацилирования тРНК (S3D Fig). Мы также проанализировали связывание с транскрибированными in vitro тРНК человека (S3E Fig) и обнаружили, что DENR-MCTS1 связывает все протестированные тРНК с одинаковой аффинностью (S3E’ Fig).Это похоже на то, что было описано для eIF2D [6], что указывает либо на то, что эти факторы повторной инициации менее эффективны, чем eIF2, в различении тРНК, либо на то, что in vivo могут быть вовлечены дополнительные факторы для улучшения селективности тРНК.

    Чтобы предсказать остатки в PUA-домене MCTS1, способствующие связыванию тРНК, мы наложили MCTS1 на архейную тРНК-гуанинтрансгликозилазу (TGT) в комплексе с тРНК [27]. TGT содержит домен PUA, который использовали для структурного выравнивания (рис. 3A), что позволяет предположить, что MCTS1 Phe104 может участвовать в связывании тРНК.MCTS1 Phe104 находится в положении, сходном с положением фенилаланина в домене TGT-PUA, которое укладывается напротив последнего основания плеча акцептора тРНК (Phe519, рис. 3A, правая панель). Напротив, MCTS1 Ala109 расположен в месте, где более объемный остаток будет мешать связыванию тРНК. Чтобы проверить эти предсказания, мы провели анализ сдвига в геле и обнаружили, что мутация Phe104 или Ala109 в более объемный аспартат приводит к значительно меньшему связыванию тРНК комплексом DENR-MCTS1 (рис. 3B-3B’). Важно отметить, что MCTS1, содержащий любую мутацию, по-прежнему был способен коиммунопреципитировать эндогенный DENR в клетках HeLa (рис. 3C и рис. S4A) и имел кривые плавления, сходные с MCTS1 WT (рис. S4B), что указывает на то, что MCTS1 [F104D] и MCTS1 [A109D] правильно уложены. и что эти два сайта специфически нарушают связывание тРНК, но не связывание DENR.Мутация MCTS1 Ala109 на Leu, которая сохраняет гидрофобность, также притупляла связывание тРНК (рис. 3D), но не связывание DENR (рис. S4A). В отличие от мутации F104D введение отрицательных зарядов в ряд других поверхностных остатков, таких как G100D, R54E и R74E, не нарушало связывание тРНК (рис. S5B). Вместе эти данные показывают, что комплекс DENR-MCTS1 способен связывать тРНК in vitro в отсутствие рибосом.

    Рис. 3. Связывание комплекса DENR-MCTS1 с тРНК необходимо для функционирования.

    (A) Сравнение MCTS1 с TGT (PDB-ID: 1J2B). TGT (голубой, показана только одна молекула из димера) также содержит домен PUF1947 и PUA, которые непосредственно взаимодействуют с тРНК (лента, оранжевый). Хотя С-концевой домен MCTS1 хорошо накладывается друг на друга, N-концевые домены PUF1947 обнаруживают различия. MCTS1-Phe104 и TGT-Phe519 складываются относительно последнего основания в акцепторном стебле, тем самым «измеряя» длину тРНК. В положении MCTS1-Ala109 TGT содержит остаток лизина.(B-B’) Мутации MCTS1 F104D и A109D сильно нарушают связывание тРНК, согласно анализу сдвига в геле, репрезентативному для 4 биологических повторов). (C) Мутации MCTS1 F104D и A109D не нарушают связывание с DENR. Варианты MCTS1 с меткой FLAG были получены IP из клеток HeLa, а коиммунопреципитирующий эндогенный DENR был обнаружен с помощью иммуноблота (представитель 2 биологических повторов, за исключением легкого снижения связывания DENR с помощью мутации A109D, что не является репрезентативным — см. S4A Fig). ( D ) Мутация A109L MCTS1 нарушает связывание тРНК, что определяется анализом сдвига в геле (представитель 3 биологических повторов).(E) Мутации MCTS1 F104D, A109D и A109L нарушают способность комплекса DENR-MCTS1 способствовать повторной инициации трансляции, тогда как мутация F104A этого не делает. Активность мутантов MCTS1 оценивают путем воссоздания клеток HeLa с нокдауном MCTS1 мутантными конструкциями сверхэкспрессии MCTS1. Конструкции сверхэкспрессии также содержат синонимичные замены, чтобы избежать нокдауна, опосредованного siRNA. Активность оценивают как способность способствовать повторной инициации трансляции ниже stuORF, как ранее сообщалось в [10].( н = 4). Базовые данные доступны в S1 Data. DENR, фактор повторного инициирования и высвобождения, регулируемый плотностью; FLuc, люцифераза светлячка; IP, иммунопреципитация; MCTS1, множественные копии при Т-клеточной лимфоме-1; PUA, псевдоуридинсинтаза и археозинтрансгликозилаза; ППУ1947; RLuc, люцифераза Renilla; siRNA, малая интерферирующая РНК; stuORF, восходящая открытая рамка считывания с сильным контекстом инициации; TGT, тРНК-гуанинтрансгликозилаза; WT, дикий тип.

    https://дои.org/10.1371/journal.pbio.2005160.g003

    Связывание DENR-MCTS1 с тРНК важно для функции повторной инициации

    Затем мы проверили, требуется ли связывание тРНК комплексом DENR-MCTS1 для стимуляции повторной инициации трансляции в клетках HeLa. Мы использовали репортерный анализ stuORF и установку восстановления, при которой мы сбивали эндогенный MCTS1 с помощью siRNAs, а затем трансфицировали клетки для повторной экспрессии либо WT, либо мутантного MCTS1 (рис. 3E). В отличие от WT MCTS1, который полностью восстанавливал репортерную активность stuORF в клетках с нокдауном MCTS1, MCTS1[F104D], MCTS1[A109D] и MCTS1[A109L] были нарушены в их способности способствовать повторной инициации (рис. 3E и S5C–S5C’).В отличие от мутанта димеризации DENR, MCTS1[F104D] и MCTS1[A109D] экспрессировались на одинаково высоких уровнях, как и MCTS1 дикого типа (S5C’ рис.), исключая это как возможное объяснение их нарушенной функции и показывая, что связывание тРНК не влияет на стабильность комплекса ДЭНР–MCTS1. Мутация MCTS1 Phe104 на аланин не нарушала ни связывание тРНК (рис. S5A), ни активность повторной инициации (рис. 3E), что указывает на то, что эта мутация является более мягкой, чем мутация F104D, и что связывание тРНК и активность повторной инициации коррелируют.В целом, эти данные указывают на то, что способность комплекса DENR-MCTS1 связывать тРНК является критической для его способности способствовать повторной инициации трансляции, тем самым идентифицируя молекулярную функцию этого комплекса, необходимую для его активности.

    Обсуждение

    Как и инициация трансляции, повторная инициация трансляции представляет собой последовательность тщательно организованных молекулярных событий. Хотя эта последовательность событий была тщательно изучена для канонической кеп-зависимой инициации, гораздо меньше известно о шагах повторной инициации трансляции.Кроме того, мы также не до конца понимаем, какие молекулярные функции необходимы для различных стадий повторной инициации. Мы представляем здесь кристаллическую структуру MCTS1, связанного с фрагментом DENR. Основываясь на этой структуре, мы идентифицируем и экспериментально подтверждаем, что остатки DENR Glu42, Tyr43 и Tyr46 важны для связывания MCTS1, а остаток Phe104 MCTS1 важен для связывания тРНК. Путем мутации этих остатков мы обнаружили, что как гетеродимеризация DENR-MCTS1, так и связывание тРНК являются важными молекулярными функциями для этого комплекса, способствующими повторной инициации трансляции.Таким образом, это связывает молекулярные функции DENR и MCTS1 с их вкладом в процесс реинициации трансляции. Мы также обнаружили, что комплекс DENR-MCTS1 способен связывать тРНК в отсутствие рибосомы, образуя тримерный комплекс in vitro. Эта активность не была обнаружена в прошлом, скорее всего, потому, что DENR и MCTS1 должны быть коэкспрессированы и совместно очищены, чтобы быть активными (см. следующий абзац). Эти результаты повышают вероятность того, что комплекс DENR-MCTS1 сначала связывает тРНК в цитозоле, а затем рекрутирует ее на рибосому, аналогично рекрутированию инициаторной тРНК на рибосому с помощью eIF2 во время канонической инициации (Fig 4).

    Рис. 4. Предполагаемая модель роли DENR-MCTS1 в инициации трансляции.

    DENR-MCTS1 связывает тРНКи и впоследствии рекрутирует ее на 40S рибосомную субъединицу для повторной инициации. DENR, фактор повторного инициирования и высвобождения, регулируемый плотностью; MCTS1, множественные копии при Т-клеточной лимфоме-1; тРНКи, интерференция тРНК.

    https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2005160.g004

    Одним из неожиданных открытий было то, что если мы смешали in vitro белки DENR и MCTS1, каждый из которых был индивидуально экспрессирован и очищен в E . coli , они образуют комплекс, но не дают комплекса, способного связывать тРНК (рис. S3A). Напротив, комплекс DENR-MCTS1, образованный in vivo (при коэкспрессии и очистке из E . coli в виде единого комплекса), легко связывает тРНК, как показывают анализы сдвига в геле (S3A Fig). Одна из возможностей заключается в том, что одному или обоим белкам могут потребоваться шапероны для формирования оптимального комплекса. Это открытие, вероятно, полезно для будущей работы, направленной на воссоздание DENR-MCTS1-зависимой трансляции in vitro.

    Исходя из нашей структуры MCTS1–DENR(aa24–51), предполагается, что Phe104 MCTS1 складывается относительно последнего основания в акцепторной ножке тРНК, тем самым «измеряя» длину тРНК и позволяя РНК, которые заканчиваются в этом положении, связывать эффективно. Это может различать тРНК и другие виды РНК, связывающиеся с этим сайтом. Чтобы способствовать повторной инициации трансляции, можно предсказать преимущественное связывание комплекса DENR-MCTS1 с инициирующей тРНК. Однако наши анализы сдвига в геле показывают, что комплекс DENR-MCTS1 аналогично связывается со всеми тРНК in vitro.Подобное отсутствие способности строго различать разные тРНК или незаряженные и ацилированные тРНК также наблюдалось для гомологичного белка eIF2D [6]. Таким образом, эта более широкая способность к связыванию тРНК может представлять особенность повторной инициации трансляции, которая отличается от канонической кэп-зависимой инициации трансляции, или она может указывать на то, что дополнительные факторы играют роль in vivo, помогая DENR-MCTS1 выбирать правильную тРНК. Интересно, что K d , который мы измерили на связывание тРНК (1.5 мкМ) примерно равна внутриклеточной концентрации тРНК в клетках HeLa. Для более подробного анализа этих аспектов потребуется дальнейшая работа.

    Интересно, что мы обнаружили, что мутант DENR[RAA], у которого нарушено связывание MCTS1, не так хорошо экспрессируется в клетках HeLa, как DENR[WT]. Одна возможность состоит в том, что DENR[RAA] имеет более низкую стабильность белка по сравнению с DENR[WT]. Это согласуется с нашими предыдущими выводами о том, что DENR и MCTS1 созависимы друг от друга в плане стабильности; нокдаун либо DENR, либо MCTS1 с использованием нескольких различных независимых siRNAs либо в клетках человека, либо в клетках мух приводит к тому, что содержание другого белка также снижается [10,17,25].Следовательно, DENR и MCTS1 могут нуждаться в образовании комплекса для стабилизации, что может объяснить пониженную стабильность белка DENR[RAA].

    При составлении этой рукописи была опубликована кристаллическая структура низкого разрешения DENR и MCTS1, связанного с 40S рибосомной субъединицей [20], а также EM-структура низкого разрешения eIF2D, связанного с 40S рибосомной субъединицей [19]. Хотя связывание DENR и MCTS1 с 40S также было показано и описано в [19], данные ЭМ этого комплекса не депонированы, поэтому детальное сравнение не представляется возможным.Вместо этого в работе [19] мы сравниваем нашу структуру DENR-MCTS1 со структурой гомологичного eIF2D, учитывая, что DENR и MCTS1 занимают те же сайты связывания на рибосоме, что и соответствующие участки гомологии eIF2D. Обе структуры показывают, что домен супрессоров мутаций кодона инициации 1 (SUI1) DENR имеет складку, аналогичную eIF1, и что DENR связывает рибосому в том же сайте, что и eIF1. Однако эти два исследования различаются тем, касаются ли DENR и MCTS1 напрямую друг друга. В то время как в кристаллической структуре 6 Å наблюдается прямой контакт между обоими белками [20], в структуре крио-ЭМ 10 Å они, по-видимому, не взаимодействуют [19].Как соотносится с этими структурами наша рентгеновская структура выделенного комплекса MCTS1–DENR? N-концевая область DENR в нашей гетеродимерной структуре хорошо соответствует соответствующей плотности, присутствующей в кристаллической структуре 40S [20] (S1H Fig), что позволяет предположить, что гетеродимер, содержащий N-концевую область DENR, ведет себя как твердое тело. Хотя как структура DENR-MCTS1, так и eIF2D, связанного с 40S, показывают, что эти белки контактируют с тРНК, их конформации и их сайты контакта с тРНК различны.Моделирование нашей структуры DENR-MCTS1 на структуру eIF2D-40S из [19] предсказывает, что MCTS1 Phe104 взаимодействует с тРНК, что согласуется с тем, что мы наблюдаем в нашей структуре и экспериментально с помощью анализов сдвига в геле. Напротив, структура 40S-DENR-MCTS1 [20] при моделировании 48S PIC [28] не предсказывает, что Phe104 контактирует с тРНК. Кроме того, остатки MCTS1, такие как K139, которые, согласно моделированию в [20], связывают тРНК, фактически участвуют в связывании DENR в нашей структуре.Следовательно, структура в [20] может представлять другой этап в процессе повторной инициации.

    Таким образом, наша структура комплекса DENR-MCTS1 расширяет современное понимание неканонической инициации трансляции, определяя две различные функции этого комплекса на молекулярном уровне. Мы идентифицируем остатки на DENR и MCTS1, важные для гетеродимеризации и связывания тРНК, и добавляем к текущей модели того, как комплекс DENR-MCTS1 способствует повторной инициации трансляции, обнаружив, что этот комплекс может связывать тРНК в отсутствие рибосомы.Для дальнейшего совершенствования этой модели потребуется дополнительная работа.

    Материалы и методы

    Плазмиды и праймеры

    Последовательности для всех олигонуклеотидов, используемых для клонирования, представлены в таблицах S1 и S2.

    ORF hDENR амплифицировали из кДНК клеток HeLa с использованием олигонуклеотидов OSS 366/367 и клонировали в сайты NcoI/NotI векторов pET-hisTEV (pETM10) и pET-his. Плазмиды для одновременной экспрессии MCTS1 и фрагментов DENR с N-концевой меткой HIS в E . coli были созданы путем ПЦР-амплификации фрагментов DENR из pET-HIS-DENR с использованием олигонуклеотидов, перечисленных в таблице S1, и их клонирования в сайты XbaI/NotI вектора двойной экспрессии pETDuet под контролем промотора Т7. ORF MCTS1 человека амплифицировали с помощью ПЦР с олигонуклеотидами OSS 341/373 и клонировали в сайты MfeI/XhoI ниже ORF DENR и под контролем собственного промотора Т7. Все плазмиды были проверены секвенированием.

    Для создания двойных или тройных мутаций DENR в а.с. E42, Y43 и Y46 для точечного мутагенеза использовали праймеры, содержащие комбинации либо двойных, либо всех трех мутаций (таблица S1) в сочетании с фланкирующими праймерами OSS 649/367, а Продукт ПЦР клонировали непосредственно в вектор pETDuet-MCTS1-HIS-FL с использованием сайтов XbaI/NotI.Все плазмиды были проверены секвенированием.

    Для мутации MCTS1 с С-концевой меткой HIS в векторе pETDuet использовали расположенные выше и ниже олигонуклеотиды OSS341 и OSS459 в сочетании с праймерами, содержащими мутации для F104D и A109D (таблица S1), для амплификации мутированной ORF, которая была клонирована в TOPO вектор (Invitrogen), секвенировали, а затем субклонировали в рамке считывания с С-концевым 6xHIS в сайты MfeI/XhoI вектора pETDuet-DENR.

    Для экспрессии меченых на N-конце HA-DENR[WT] и HA-DENR[E42R, Y43A, Y46A] («HA-DENR[RAA]») под контролем промотора CMV в клетках HeLa, WT и мутантных ORF DENR амплифицировали с использованием олигонуклеотидов OSS 072 и OSS 367 из соответствующих бактериальных экспрессионных плазмид, клонировали через сайты EcoRI и NotI в вектор экспрессии pCDNA-HA и секвенировали для корректности.

    Для экспериментов с люциферазой восстановления DENR и MCTS1 в клетках HeLa в [17] описаны репортеры люциферазы светлячка и люциферазы Renilla. Для экспрессии вариантов DENR и MCTS1, избегающих нокдауна, опосредованного siRNA, ОРС DENR и MCTS1, содержащие синонимичные мутации, ранее описанные в [17], использовали в качестве матриц для сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов OSS684/OSS685 (для DENR) или OSS702/OSS703 и OSS706. /OSS707 (для MCTS1).

    Для получения MCTS1 с С-концевой меткой Flag в виде версий WT, F104D и A109D ORF WT и мутантных MCTS1 амплифицировали с праймерами OKE084 и OSS 745 (содержащими ORF FLAG, полные последовательности в таблице S2) из ​​бактериальных векторов экспрессии, клонировали в pRK, содержащую промотор CMV, и секвенировали для корректности.

    Антитела

    Античеловеческие DENR и античеловеческие MCTS1 для иммуноблоттинга были получены в лаборатории путем иммунизации морских свинок полноразмерными рекомбинантными белками. Антитубулин был приобретен у Sigma (T9026).

    Экспрессия и очистка белков

    Белки экспрессировали с использованием E . Клетки coli BL21 (DE3) в среде 2YT с добавлением либо канамицина (30 мкг/мл), либо ампициллина (100 мкг/мл), в зависимости от используемой плазмиды. Клетки выращивали до OD 600 , равной 0.8–1,0 при 37°С, затем сдвигается до 18°С. Экспрессию индуцировали добавлением 0,4 мМ IPTG, клетки выращивали далее в течение ночи, собирали центрифугированием, а клеточные осадки либо сразу использовали для лизиса и очистки, либо замораживали с помощью LN -2- и хранили при -20°C.

    Все варианты комплекса DENR-MCTS1 очищали с помощью N- или C-концевой His 6 -метки с использованием NiNTA и SEC. Клетки ресуспендировали в лизирующем буфере (30 мМ HEPES, 30 мМ имидазол, 500 мМ NaCl) и лизировали с помощью микрофлюидизатора (Microfluidics) при 0.55 МПа. Лизат очищали центрифугированием в течение 35 мин при 35000 g и 4°C, полученный супернатант наносили на колонку NiNTA объемом 2 мл. Колонку промывали 25–50 колоночными объемами лизирующего буфера и элюировали элюирующим буфером (лизирующий буфер плюс 400 мМ имидазола). NiNTA-элюат наносили на колонку Superdex 200 26/60, уравновешенную SEC-буфером I (10 мМ HEPES, pH 7,5, 500 мМ NaCl). Пиковые фракции, содержащие комплекс DENR-MCTS1, объединяли, концентрировали до концентрации 10–15 мг/мл и либо использовали напрямую, либо подвергали шоковой заморозке с LN 2 и хранили при -80°C.

    Кристаллизация и определение структуры

    Попытки кристаллизовать полноразмерный комплекс DENR–MCTS1, а также различные укорочения не увенчались успехом, поэтому мы сосредоточились на минимальном комплексе. Минимальный комплекс DENR-MCTS1 очищали, как описано выше в разделе «Экспрессия и очистка белков», из бактерий, коэкспрессирующих немеченый полноразмерный MCTS1 дикого типа вместе с меченым NHis 6 DENR aas 24–51. Кристаллы были получены методом диффузии паров сидячей капли при 18°С в условиях, содержащих 0.2 М AmSO 4 и 20% ПЭГ3350. Перед сбором данных кристаллы собирали в резервуарном растворе с добавлением 20% глицерина и мгновенно охлаждали жидким азотом. Данные дифракции были собраны на линии луча ESRF ID23-2 и интегрированы с XDS [29] и дополнительно обработаны с помощью AIMLESS [30] из пакета CCP4 [31]. Кристаллы относятся к пространственной группе P 4 1 22. Структура расшифрована методом молекулярной замены, реализованным в MOLREP [32]. В качестве модели поиска использовали координаты варианта кристаллизации MCTS1 (PDB-ID: 3R90).Очень сильная положительная плотность наблюдалась вблизи His58. Структура была перестроена вручную в COOT [33] и уточнена с помощью REFMAC5 [34] и PHENIX [35]. Карты аномальной плотности были рассчитаны с помощью ANODE [36], показывая четкий пик (14 σ) вблизи His58, который первоначально был отнесен к Zn 2+ . Идентичность иона Zn 2+ — была подтверждена спектром XRF, полученным на линии луча ESRF ID23-1 [37]. Данные РФА анализировали с помощью PyMCA [38]. Основываясь на знании того, что ион Zn 2+ связан между двумя белками, мы собрали один набор данных на Zn-крае, а также смогли решить структуру de novo с помощью Zn-SAD.Подготовка данных, определение местоположения тяжелых атомов и фазирование выполнялись с помощью конвейера SHELXC/D/E [39] с навигацией по HKL2MAP [40]. Окончательная структура содержит один комплекс DENR–MCTS1. Статистика сбора и уточнения данных представлена ​​в таблице 1. Структурные сравнения были выполнены с помощью GESAMT [41]. Определение консервативных остатков и проекцию на поверхность проводили с помощью ConSurf [42]. Все структурные фигуры были подготовлены с помощью PyMOL.

    Эксперименты по коиммунопреципитации в клетках HeLa

    Для экспериментов по коимунальной преципитации клетки HeLa высевали в течение ночи и трансфицировали на следующий день конструкциями для экспрессии с использованием Effectene (Qiagen) в соответствии с протоколом производителя.Через 2 дня экспрессии клетки собирали и лизировали в буфере RIPA (50 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, 1% Nonidet P-40) с добавлением ингибиторов протеаз (Roche ) и бензоназа (Мерк). После центрифугирования в течение 10 минут при 10 000 g для удаления нерастворимого клеточного детрита к суспензии добавляли предварительно промытую HA-агарозную аффинную матрицу (Roche 11815016001, использованная на рис. 2C) или анти-Flag Affinity Beads (Sigma A2220, использованная на рис. 3D). После 1,5 ч вращения в холодильной камере шарики собирали центрифугированием, промывали буфером RIPA 4 раза и подвергали электрофорезу в электрофорезе с последующим иммуноблоттингом.

    Анализы восстановления в клетках HeLa

    Для экспериментов по восстановлению клетки HeLa подвергали обратной трансфекции контрольной миРНК (анти-lacZ, Dharmacon #D00-2000-01-20) или миРНК против DENR или MCTS1 (Dharmacon, последовательности представлены в таблице S3) с использованием RNAi Max (Thermo Scientific). . Образцы в трех повторностях в 96-луночном формате для анализа люциферазы обрабатывали параллельно с образцами вестерн-блоттинга в 24-луночном формате. Через 2 дня после нокдауна все образцы трансфицировали репортерами люциферазы, с конструкциями спасения или без них, как опубликовано в [17], и инкубировали в течение 2 дней дольше.Количества плазмидной ДНК, трансфицированной на 24 лунки, были следующими: 0,5 мкг каждой репортерной плазмиды FLuc и Rluc; и для восстановления уровней DENR 0,1 мкг плазмиды pCDNA-DENR[WT] или 0,26 мкг плазмиды pCDNA-DENR[RAA]. Затем клетки для иммуноблоттинга лизировали в буфере RIPA, содержащем ингибиторы протеаз и бензоназу, в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем лизаты осветляли центрифугированием в течение 5 мин при 10 000 g. Наконец, добавляли буфер Лэммли до 1x конечной концентрации для SDS-PAGE и иммуноблоттинга.Для анализов на люциферазу клетки лизировали и анализировали с помощью системы репортерного анализа Dual-Luciferase от Promega (#E1960).

    тРНК

    Смесь тРНК дрожжей

    была приобретена у Ambion (№ AM7119). Индивидуальные тРНК дрожжей, ацилированные или неацилированные, были приобретены у компании tRNA Probes, College Station, USA (iMet tRNA кат. № MI-03; iMet тРНК-Met кат. № MI-60; Lys тРНК кат. № L-03; Lys тРНК-Lys). кат. № L-60; цис-тРНК, кат. № С-03; цис-тРНК-цис, кат. № С-60).

    ТРНК человека, транскрибированные in vitro, были получены путем отжига олигонуклеотидов, содержащих 5′-промотор Т7, за которым следовала последовательность тРНК.Олигопоследовательности представлены в таблице S4. Олигонуклеотиды отжигали путем нагревания до 95°C и медленного уравновешивания до комнатной температуры. тРНК транскрибировали in vitro, комбинируя и инкубируя отожженные олигонуклеотиды (1 мкМ), НТФ (2 мМ), неорганическую фосфатазу (3 ед/100 мкл), риболок (100 ед/100 мкл) и Т7-РНК-полимеразу (60 ед/100 мкл). мкл; все от Thermo Scientific) в течение 3 ч при 37°C.

    После реакций транскрипции in vitro все РНК очищали с использованием Trizol (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя.

    анализы сдвига тРНК в геле

    Для анализа сдвига электрофоретической подвижности тРНК в E экспрессировался либо один HIS-меченый DENR, либо MCTS1. coli Rosetta pLysS и очищали на аффинных колонках His-Trap (GE Healthcare), или два белка коэкспрессировали и очищали на шариках Ni-NTA Agarose (Qiagen). Белки элюировали в реакционном буфере (50 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 15 мМ имидазол, ингибиторы протеазы Roche без ЭДТА), содержащем 300 мМ имидазола.После элюирования добавляли 2 мМ ДТТ. Различные количества белка смешивали вместе с РНК и 0,5 мкл Ribolock (Thermo Scientific #EO0381) в общем объеме 20 мкл реакционного буфера для получения конечных концентраций белка от 0,25 мкМ до 16 мкМ в реакционной смеси. Конечные концентрации РНК в реакциях связывания составляли 3 мкМ для смеси тРНК дрожжей и 1 мкМ в других случаях. После 30 мин инкубации на льду к образцам добавляли загрузочный буфер, содержащий ДНК/РНК-краситель GelRed, и загружали в нативный агарозный гель с последующим электрофорезом при 9 вольт/см длины геля в течение 33 мин при 4°C.Для расчета K d для связывания тРНК интегральную плотность сдвинутой полосы количественно определяли с помощью ImageJ. Исходя из этого, процент тРНК, связанной с DENR•MCTS1 («тета»), рассчитывали для каждой концентрации DENR-MCTS1. Это использовали для получения количества комплекса тРНК • DENR • MCTS1 и количества свободного DENR • MCTS1. Затем для расчета Kd использовали линейную регрессию Скэтчарда. Это было сделано для 5 биологических повторностей.

    Количественное определение Zn

    2+ связывание Связывание

    Zn 2+ анализировали с использованием протокола, адаптированного из [21,22]: белки DENR-MCTS1 экспрессировали в E . coli и очищали в отсутствие DTT, как описано выше в разделе «Экспрессия и очистка белков». После элюции в элюирующем буфере (20 мМ Hepes, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 330 мМ имидазол) как WT, так и мутантные белки разводили в элюирующем буфере до равной концентрации 1,1 мг/мл. Белковые растворы затем обрабатывали 10 мМ NEM (N-этилмалеимид, Sigma, #E3876) в течение 10 минут при 37°C для высвобождения Zn 2+ . Затем образцы нагревали в течение 5 мин при 95°C для полной денатурации белков, а затем центрифугировали в течение 5 мин при 20 000 g для центрифугирования осадка.Затем в супернатанте измеряли цинк. Для измерения цинка 40 мкл 5 мМ PAR (Sigma #323209) объединяли с 15 мкл стандартных растворов ZnCl 2 (от 1 мкМ до 100 мкМ, также в элюирующем буфере) или с 15 мкл очищенного раствора образца. Образцы смешивали, инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин и затем измеряли поглощение при 500 нм.

    Кривые плавления

    Температуры плавления комплексов DENR-MCTS1 дикого типа и мутантов определяли с помощью Prometheus NT.48 (Nanotemper, Германия) в концентрации 1 мг/мл. Запускали градиент температуры от 20 до 80°С со скоростью 1,5°С/мин, при этом регистрировали флуоресценцию триптофана при 330 и 350 нм. Температуры плавления определяли с использованием программного обеспечения, поставляемого производителем, которое вычисляет соотношение между значениями флуоресценции при 350 и 330 нм. Соотношение 350/330 нанесено на график в зависимости от температуры, и первая производная используется для определения температуры плавления.

    Дополнительная информация

    S1 Рис.Поддержка основного рис. 1.

    (A) Первые 46 аминокислот DENR необходимы для связывания MCTS1. MCTS1, помеченный HIS, коэкспрессировался с WT или мутантным DENR, лишенным первых 46 а.о. (DENR-47-C) в E . coli , и связывание оценивали путем очистки MCTS1 с помощью аффинной очистки никеля и обнаружения соочистки DENR. − неиндуцированный, + индуцированный IPTG, «P» (нерастворимый осадок), «SN» (растворимый супернатант), «FT» (проточный на колонке с никелем), «E» (элюат). (B-E) Последовательные усечения N-конца DENR идентифицируют аминокислоты 24–51 как минимальный пептид, способный связывать MCTS1. (F) Спектры излучения XRF типичного кристалла DENR-MCTS1, записанные в диапазоне 2–14 кэВ на канале ESRF ID23-1. Пик при 8,639 кэВ указывает на присутствие цинка. (G) Cys37 DENR участвует в связывании цинка. Белки DENR-MCTS1, содержащие указанные мутации DENR, были очищены от E . coli , и количество связанного Zn 2+ определяли с использованием PAR, который поглощает при 500 нМ при связывании Zn 2+ . «4Cmut» указывает на мутацию всех четырех цистеинов C34A, C37Y, C44A и C53A.( n = 3, планки погрешностей = SD). Базовые данные доступны в S1 Data. (H) Структура MCTS1 по существу (RMSD 0,716 Å для 181 остатка) такая же, как ранее сообщалось для MCTS1, содержащего три мутации E137A, K139A и Q140A («MCTS1x»; PDB-ID: 3R90, цепь A ). (I) Докинг минимальной структуры DENR–MCTS1 в карту электронной плотности 5VYC. Электронная плотность для MCTS1 (2Fo-Fc, синяя сетка) и DENR-N (Fo-Fc, оранжевая сетка) обозначена как 1.5σ. Пептид DENR не полностью занимает плотность, что позволяет предположить, что большее количество остатков образует стабильную складку, чем присутствует в нашей конструкции. Отсутствие непрерывной плотности между DENR-N и -C предполагает наличие гибкого линкера (пунктирные линии). аа, аминокислота; DENR, фактор повторного инициирования и высвобождения, регулируемый плотностью; ESRF, Европейский центр синхротронного излучения; HIS, полигистидин; MCTS1, множественные копии при Т-клеточной лимфоме-1; PAR, 4-(2-пиридилазо)резорцин; RMSD, среднеквадратичное отклонение; WT, дикий тип; РФА, рентгенофлуоресценция.

    https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2005160.s001

    (TIF)

    S2 Рис. Поддержка основного рис. 2.

    (A) Мутация MCTS1 His58 в аланин не отменяет связывания между MCTS1 и либо полноразмерным DENR (A), либо пептидом DENR aas 24–51 (A’). Варианты DENR и MCTS1 коэкспрессировались в E . кишечная палочка . HIS-меченый белок подвергали аффинной очистке на колонке с никелем, и в элюате оценивали соочистку белка-партнера.«FT» (проточная на никелевой колонке), «W» (промывка), «E» (элюат). (B) Вид поверхности MCTS1 с остатками, окрашенными в результате консервации (от голубовато-зеленого до темно-красного в зависимости от степени консервации соответственно). Остатки вдоль области связывания DENR высококонсервативны, за исключением Gln140 и His141, поскольку во взаимодействии участвуют не боковые цепи, а основная цепь (вставка, подробный вид на нижней панели). (C) Тройная мутация DENR E42R, Y43A, Y46A, но не двойная мутация Y43A, Y46A, отменяет связывание DENR с MCTS1.HIS-меченые варианты DENR экспрессировались в E . coli вместе с полноразмерным немеченым MCTS1. HIS-меченый DENR подвергали аффинной очистке на колонке с никелем, и в элюате оценивали соочищение MCTS1. «FT» (проточная на никелевой колонке), «W» (промывка), «E» (элюат). (D) DENR[E42R, Y43A, Y46A] («DENR[RAA]») менее стабилен или экспрессируется хуже, чем DENR[WT]. Эндогенный DENR был нокдаун с помощью siRNAs в клетках HeLa, и экспрессия DENR была восстановлена ​​путем экспрессии WT или мутантного DENR, содержащего синонимичные мутации в ORF, чтобы избежать нокдауна, опосредованного siRNA.В то время как 0,4 мкг экспрессионной плазмиды DENR[WT] восстанавливают DENR до уровней эндогенного белка (дорожки 1 и 6), 0,4 мкг экспрессионной плазмиды DENR[RAA] этого не делают. аа, аминокислота; DENR, фактор повторного инициирования и высвобождения, регулируемый плотностью; HIS, полигистидин; MCTS1, множественные копии при Т-клеточной лимфоме-1; ORF, открытая рамка считывания; siRNA, малая интерферирующая РНК; WT, дикий тип.

    https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2005160.s002

    (TIF)

    S3 Рис. Подставка к основному рис. 3.

    (A) Комплекс DENR–MCTS1, полученный коэкспрессией DENR и MCTS1 в E . coli , связывает тРНК, анализировали методом сдвига в геле с использованием тРНК дрожжей. Каждый белок сам по себе не связывает тРНК, и комплекс, восстановленный путем экспрессии и очистки каждого белка отдельно от бактерий, а затем смешивания их в реакционной пробирке, также не связывает тРНК. «DENR-MCTS1» указывает, что два белка коэкспрессировались в бактериях, тогда как «DENR+MCTS1» указывает, что каждый белок был экспрессирован и очищен отдельно в E . coli , а затем смешали вместе. (Представитель 3 биологических повторов). (B) DENR[E42R, Y43A, Y46A] («RAA»), который не может связываться с MCTS1, не связывает тРНК, согласно анализу сдвига в геле с использованием тРНК дрожжей. (C) DENR-MCTS1 связывает тРНК в диапазоне концентраций соли от 150 мМ NaCl до 500 мМ NaCl. (D) Связывание DENR-MCTS1 с тРНК дрожжей в их неацилированном (дорожки 1–6) или ацилированном состоянии (дорожки 7–12). DENR-MCTS1 связывает Cys-тРНК хуже, чем iMet-тРНК или Lys-тРНК, и не различает ацилированные и неацилированные тРНК в этой установке in vitro.Связывание оценивают с помощью анализа сдвига геля, как в (А). (E-E’) Комплекс DENR-MCTS1 связывается in vitro с различными тРНК человека с примерно одинаковым сродством. (E) Репрезентативные примеры ( n = 5). (E’) Количественная оценка Kd из 5 биологических повторов. DENR, фактор повторного инициирования и высвобождения, регулируемый плотностью; MCTS1, множественные копии при Т-клеточной лимфоме-1.

    https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2005160.s003

    (TIF)

    S4 Рис. MCTS1[F104D] и [A109D] связывают DENR и показывают кривые плавления, аналогичные WT MCTS1.

    (A) MCTS1[A09D] и MCTS1[A109L] связывают эндогенный DENR. WT с меткой FLAG и мутантный MCTS1 экспрессировались в клетках HeLa и подвергались иммунопреципитации с использованием метки FLAG. Иммунопреципитаты исследовали на связывание с эндогенным DENR. Количество коиммунопреципитированного DENR, нормализованное к количеству FLAG-MCTS1, было количественно определено с использованием системы ChemiDoc и показано ниже иммуноблотов. (B) Кривые плавления WT (зеленый) и мутантных комплексов DENR-MCTS1 (F104D и A019D, красный и синий соответственно).Отношение количества флуоресценции при 350 и 330 нм нанесено на график в зависимости от температуры (верхняя панель). Точки перегиба в соотношении 350/330, соответствующие температуре плавления, определяются первой производной, нанесенной на график зависимости от температуры (нижняя панель). Комплекс WT разворачивается при 63,8°С, мутант F104D — при 65,3°С, а A109D — при 64,0°С. DENR, регулируемый плотностью фактор повторной инициации; MCTS1, множественные копии при Т-клеточной лимфоме-1; WT, дикий тип.

    https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2005160.s004

    (ТИФ)

    S5 Рис. Дополнение к основному рис. 3.

    (A) Мутация MCTS1 F104A не нарушает связывание iMet-тРНК. Связывание тРНК, проанализированное с помощью анализа сдвига в геле, как в S3 Fig. (B) Несколько мутаций, вызывающих отрицательный заряд на поверхностных остатках MCTS1, таких как R54E, R74E и G100D, не нарушают связывание с тРНК дрожжей, проанализированное с помощью анализа сдвига в геле. (C-C’) MCTS1 должен связываться с тРНК, чтобы быть функционально активным. (C) Активность мутантов, связывающих тРНК MCTS1, анализировали путем восстановления клеток HeLa с нокдауном MCTS1 с помощью мутантных конструкций со сверхэкспрессией MCTS1.Конструкции сверхэкспрессии также содержат синонимичные замены, чтобы избежать нокдауна, опосредованного siRNA. Активность оценивают как способность способствовать повторной инициации трансляции ниже stuORF, как сообщалось ранее [10]. (C’) Уровни белка MCTS1 из того же набора клеток, что и на (C). Базовые данные доступны в S1 Data. DENR, фактор повторного инициирования и высвобождения, регулируемый плотностью; MCTS1, множественные копии при Т-клеточной лимфоме-1; siRNA, малая интерферирующая РНК; stuORF, восходящая открытая рамка считывания с сильным контекстом инициации.

    https://doi.org/10.1371/journal.pbio.2005160.s005

    (TIF)

    Благодарности

    Мы благодарим J. Kopp, C. Siegmann и G. Müller из BZH/Cluster of Excellence: платформа кристаллизации CellNetworks для кристаллизации белков, G. Müller за превосходную техническую помощь, G. Stier за экспрессионные плазмиды и поддержку на ранних стадиях проекта и ESRF за поддержку и доступ к каналам луча.

    Каталожные номера

    1. 1.Джексон Р.Дж., Хеллен К.У., Пестова Т.В. Терминация и посттерминационные события в эукариотической трансляции. Достижения в области химии белков и структурной биологии. 2012;86:45–93. пмид: 22243581.
    2. 2. Андреев Д.Е., О’Коннор П.Б., Лофран Г., Дмитриев С.Е., Баранов П.В., А.Н. Понимание механизмов эукариотической трансляции, полученное с помощью профилирования рибосом. Нуклеиновые Кислоты Res. 2017;45(2):513–26. пмид: 27923997; Центральный PMCID в PubMed: PMC5314775.
    3. 3. Инголия Н.Т., Брар Г.А., Стерн-Гиноссар Н., Харрис М.С., Талхуарн Г.Дж., Джексон С.Е. и др.Профилирование рибосом выявляет повсеместную трансляцию за пределами аннотированных генов, кодирующих белок. Сотовые отчеты. 2014;8(5):1365–79. пмид: 25159147; Центральный PMCID в PubMed: PMC4216110.
    4. 4. Ветмар К. Регуляторный потенциал вышележащих открытых рамок считывания в экспрессии эукариотических генов. Wiley междисциплинарные обзоры РНК. 2014;5(6):765–78. пмид: 24995549.
    5. 5. Мохаммад М.П., ​​Мунзарова Понделикова В., Земан Дж., Гунисова С., Валасек Л.С. In vivo доказательства того, что eIF3 остается связанным с рибосомами, удлиняющимися и заканчивающимися на коротких ORF выше по течению, чтобы способствовать повторной инициации.Нуклеиновые Кислоты Res. 2017;45(5):2658–74. пмид: 28119417; Центральный PMCID в PubMed: PMC5389480.
    6. 6. Дмитриев С.Е., Теренин И.М., Андреев Д.Е., Иванов П.А., Дунаевский Ю.Е., Merrick WC, et al. GTP-независимая доставка тРНК к Р-сайту рибосомы с помощью нового эукариотического фактора трансляции. Журнал биологической химии. 2010;285(35):26779–87. Эпб 2010/06/23. doi: M110.119693 [pii] pmid:20566627; Центральный PMCID в PubMed: PMC2930676.
    7. 7. Скабкин М.А., Скабкина О.В., Дхоте В., Комар А.А., Хеллен К.У., Пестова Т.В.Активность лигатина и MCT-1/DENR в эукариотической инициации трансляции и рециркуляции рибосом. Гены Дев. 2010;24(16):1787–801. Эпб 2010/08/18. doi: 16.24.1787 [pii] pmid:20713520; Центральный PMCID в PubMed: PMC2922506.
    8. 8. Скабкин М.А., Скабкина О.В., Хеллен К.Ю., Пестова Т.В. Реинициация и другие нетрадиционные посттерминационные события во время эукариотической трансляции. Мол Ячейка. 2013. пмид: 23810859.
    9. 9. Зиновьев А, Хеллен К.У., Пестова Т.В. Множественные механизмы повторной инициации мРНК бицистронного калицивируса.Мол Ячейка. 2015;57(6):1059–73. пмид: 25794616; Центральный PMCID в PubMed: PMC4521216.
    10. 10. Schleich S, Strassburger K, Janiesch PC, Koledachkina T, Miller KK, Haneke K, et al. DENR-MCT-1 способствует повторной инициации трансляции ниже uORF для контроля роста ткани. Природа. 2014;512(7513):208–12. пмид: 25043021; Центральный PMCID в PubMed: PMC4134322.
    11. 11. Просняк М., Диеров Дж., Оками К., Тилтон Б., Джеймсон Б., Савайя Б.Э. и соавт. Новый онкоген-кандидат, MCT-1, участвует в развитии клеточного цикла.Исследования рака. 1998;58(19):4233–7. пмид:9766643.
    12. 12. Ши Б., Хсу Х.Л., Эвенс А.М., Гордон Л.И., Гартенхаус Р.Б. Экспрессия онкогена-кандидата MCT-1 в В- и Т-клеточных лимфоидных злокачественных опухолях. Кровь. 2003;102(1):297–302. пмид: 12637315.
    13. 13. Хсу Х.Л., Ши Б., Гартенхаус РБ. Продукт онкогена MCT-1 нарушает контроль контрольных точек клеточного цикла и трансформирует эпителиальные клетки молочной железы человека. Онкоген. 2005;24(31):4956–64. пмид: 15897892.
    14. 14. Диеров Дж., Просняк М., Галлия Г., Гартенхаус Р.Б.Повышенная активность циклина/cdk G1 в клетках, сверхэкспрессирующих онкоген-кандидат, MCT-1. Джей Селл Биохим. 1999;74(4):544–50. пмид:10440924.
    15. 15. Рейнерт Л.С., Ши Б., Нанди С., Мазан-Мамчарц К., Витоло М., Бахман К.Е. и соавт. Белок MCT-1 взаимодействует с кэп-комплексом и модулирует профили трансляции матричной РНК. Исследования рака. 2006;66(18):8994–9001. пмид: 16982740.
    16. 16. О Джей Джей, Гроссханс Д.Р., Вонг С.Г., Слэмон Д.Дж. Идентификация дифференциально экспрессируемых генов, связанных с гиперэкспрессией HER-2/neu в клетках рака молочной железы человека.Нуклеиновые Кислоты Res. 1999;27(20):4008–17. пмид:10497265; Центральный PMCID в PubMed: PMC148668.
    17. 17. Шлейх С., Асеведо Дж. М., Клемм фон Хоэнберг К., Телеман А. А. Идентификация транскриптов с короткими stuORF как мишеней для DENR*MCTS1-зависимой трансляции в клетках человека. Научные отчеты. 2017;7(1):3722. пмид: 28623304; Центральный PMCID в PubMed: PMC5473865.
    18. 18. Темпел В., Димов С., Тонг Ю., Пак Х.В., Хонг Б.С. Кристаллическая структура множественных копий человеческого онкопротеина Т-клеточной лимфомы-1.Белки. 2013;81(3):519–25. пмид: 23042581.
    19. 19. Вайссер М., Шафер Т., Лейбундгут М., Борингер Д., Айлетт Ч.С., Бан Н. Структурное и функциональное понимание человеческих комплексов повторной инициации. Мол Ячейка. 2017. пмид: 28732596.
    20. 20. Ломакин И.Б., Столбушкина Е.А., Вайдя А.Т., Чжао С., Гарбер М.Б., Дмитриев С.Е., и соавт. Кристаллическая структура рибосомы человека в комплексе с DENR-MCT-1. Сотовые отчеты. 2017;20(3):521–8. пмид: 28723557.
    21. 21. Хант Дж.Б., Нис С.Х., Гинзбург А.Использование 4-(2-пиридилазо)резорцина в исследованиях высвобождения цинка из аспартаттранскарбамоилазы Escherichia coli. Аналитическая биохимия. 1985;146(1):150–7. Эпб 1985/04/01. пмид: 3887984.
    22. 22. Беллини М., Лакруа Дж. К., Галл Дж. Г. Домен, связывающий цинк, необходим для нацеливания материнского ядерного белка PwA33 на петли хромосом ламповых щеток. Журнал клеточной биологии. 1995;131(3):563–70. EP 01.11.1995. пмид:7593179; Центральный PMCID PubMed: PMCPMC2120627.
    23. 23.Pace NJ, Weerapana E. Цинк-связывающие цистеины: разнообразные функции и структурные мотивы. Биомолекулы. 2014;4(2):419–34. Эпб 2014/06/28. пмид: 24970223; Центральный PMCID PubMed: PMCPMC4101490.
    24. 24. Симпсон Р.Дж., Крам Э.Д., Чолий Р., Мэтьюз Дж.М., Кроссли М., Маккей Дж.П. Производные цинковых пальцев CCHX сохраняют способность связывать Zn (II) и опосредовать взаимодействия белок-ДНК. Журнал биологической химии. 2003;278(30):28011–8. EP 2003/05/09. пмид:12736264.
    25. 25.Хаас М.А., Нго Л., Ли С.С., Шлейх С., Ку З., Ваньяй Х.К. и др. Мутации De Novo в DENR нарушают развитие нейронов и связывают врожденные неврологические расстройства с ошибочной повторной инициацией трансляции мРНК. Сотовые отчеты. 2016;15(10):2251–65. пмид: 27239039; Центральный PMCID в PubMed: PMC4

      3.
    26. 26. Перес-Арельяно И., Гальего Дж., Сервера Дж. Домен PUA — структурный и функциональный обзор. Журнал ФЭБС. 2007;274(19):4972–84. пмид: 17803682.
    27. 27. Ишитани Р., Нуреки О., Намеки Н., Окада Н., Нисимура С., Ёкояма С.Альтернативная третичная структура тРНК для распознавания ферментом посттранскрипционной модификации. Клетка. 2003;113(3):383–94. пмид:12732145.
    28. 28. Ломакин И.Б., Стейц Т.А. Инициация синтеза белков млекопитающих и механизм сканирования мРНК. Природа. 2013; 500(7462):307–11. пмид: 23873042; Центральный PMCID в PubMed: PMC3748252.
    29. 29. Кабш В. Xds. Acta crystallographica Раздел D, Биологическая кристаллография. 2010; 66 (часть 2): 125–32. пмид: 20124692; Центральный PMCID в PubMed: PMC2815665.
    30. 30. Эванс П.Р., Муршудов Г.Н. Насколько хороши мои данные и какое разрешение? Acta crystallographica Раздел D, Биологическая кристаллография. 2013; 69 (часть 7): 1204–14. пмид: 23793146; Центральный PMCID в PubMed: PMC3689523.
    31. 31. Winn MD, Ballard CC, Cowtan KD, Dodson EJ, Emsley P, Evans PR, et al. Обзор пакета CCP4 и текущих разработок. Acta crystallographica Раздел D, Биологическая кристаллография. 2011; 67 (часть 4): 235–42. пмид: 21460441; Центральный PMCID в PubMed: PMC3069738.
    32. 32. Вагин А., Тепляков А. Молекулярная замена МОЛРЕП. Acta crystallographica Раздел D, Биологическая кристаллография. 2010; 66 (часть 1): 22–5. пмид: 20057045.
    33. 33. Эмсли П., Локамп Б., Скотт В.Г., Коутан К. Особенности и разработка Coot. Acta crystallographica Раздел D, Биологическая кристаллография. 2010; 66 (часть 4): 486–501. пмид: 20383002; Центральный PMCID в PubMed: PMC2852313.
    34. 34. Муршудов Г.Н., Скубак П., Лебедев А.А., Панну Н.С., Штайнер Р.А., Николлс Р.А., и соавт.REFMAC5 для уточнения макромолекулярных кристаллических структур. Acta crystallographica Раздел D, Биологическая кристаллография. 2011; 67 (часть 4): 355–67. пмид: 21460454; Центральный PMCID в PubMed: PMC3069751.
    35. 35. Адамс П.Д., Афонин П.В., Бункоци Г., Чен В.Б., Дэвис И.В., Эколс Н. и др. PHENIX: комплексная система на основе Python для решения макромолекулярной структуры. Acta crystallographica Раздел D, Биологическая кристаллография. 2010; 66 (часть 2): 213–21. пмид: 20124702; Центральный PMCID в PubMed: PMC2815670.
    36. 36. Торн А., Шелдрик Г.М. АНОД: расчет плотности аномальных и тяжелых атомов. J Appl Crystallogr. 2011; 44 (часть 6): 1285–7. пмид: 22477786; Центральный PMCID в PubMed: PMC3246834.
    37. 37. Нуриццо Д., Майрс Т., Гихарро М., Рей В., Мейер Дж., Фахардо П. и др. Луч структурной биологии ID23-1 в ESRF. Журнал синхротронного излучения. 2006; 13 (часть 3): 227–38. пмид: 16645249.
    38. 38. Соле В.А., Папийон Э., Котте М., Уолтер П., Сусини Дж. Мультиплатформенный код для анализа энергодисперсионных спектров рентгеновской флуоресценции.Spectrochimica Acta Часть B: Атомная спектроскопия. 2007;62(1):63–8. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1016/j.sab.2006.12.002.
    39. 39. Шелдрик ГМ. Экспериментальная фаза с SHELXC/D/E: сочетание отслеживания цепи с изменением плотности. Acta crystallographica Раздел D, Биологическая кристаллография. 2010; 66 (часть 4): 479–85. пмид: 20383001; Центральный PMCID в PubMed: PMC2852312.
    40. 40. Папе Т., Шнайдер Т.Р. HKL2MAP: графический пользовательский интерфейс для фазирования макромолекул с помощью программ SHELX.Журнал прикладной кристаллографии. 2004; 37 (часть 5): 843–4.
    41. 41. Krissinel E. Расширенное распознавание складок с использованием эффективной кластеризации коротких фрагментов. Журнал молекулярной биохимии. 2012;1(2):76–85. пмид: 27882309; Центральный PMCID в PubMed: PMC5117261.
    42. 42. Ашкенази Х., Абади С., Марц Э., Чай О., Мэйроуз И., Пупко Т. и др. ConSurf 2016: усовершенствованная методология оценки и визуализации эволюционной консервации макромолекул. Нуклеиновые Кислоты Res. 2016; 44(W1):W344–50.пмид: 27166375; Центральный PMCID в PubMed: PMC4987940.

    Перевод против транскрипции: сходства и различия

    Что такое транскрипция?

    Транскрипция обычно относится к письменной форме чего-либо. В биологии транскрипция — это процесс, при котором ДНК используется в качестве матрицы для формирования комплементарной цепи РНК — РНК — это «записанная» форма ДНК. Это первая стадия производства белка или потока информации внутри клетки.ДНК хранит генетическую информацию, которая затем переносится в РНК при транскрипции, прежде чем направлять синтез белков при трансляции. Могут образовываться три типа РНК: матричная РНК (мРНК), транспортная РНК (тРНК) и рибосомальная РНК (рРНК).

    Транскрипция проходит в четыре стадии: преинициация, инициация, элонгация и терминация. Они отличаются у прокариот и эукариот тем, что у эукариот ДНК хранится в ядре, а у прокариот ДНК хранится в цитоплазме.У эукариот ДНК хранится в плотно упакованном хроматине, который должен быть раскручен, прежде чем может произойти транскрипция. Производство мРНК из РНК у эукариот особенно сложнее, чем у прокариот, и включает несколько дополнительных стадий процессинга.

    Предварительная инициация, или матричное связывание, инициируется связыванием σ-субъединицы РНК-полимеразы с промоторной областью , расположенной на 5’-конце цепи ДНК. После этого цепь ДНК денатурируется, разъединяя две комплементарные цепи и позволяя ферменту получить доступ к матричной цепи .Противоположная нить известна как партнерская нить . Промоторные последовательности на цепи ДНК жизненно важны для успешной инициации транскрипции. Промоторные последовательности представляют собой специфические последовательности рибонуклеотидных оснований, составляющих цепь ДНК (аденин, тимин, гуанин и цитозин), и была обнаружена идентичность некоторых из этих мотивов, включая TATAAT и TTGACA у прокариот и TATAAAA и GGCCAATCT у эукариот. Эти последовательности известны как цис- действующих элементов .У эукариот дополнительный фактор транскрипции необходим для облегчения связывания РНК-полимеразы с промоторной областью.

    РНК-полимераза

    катализирует инициацию, вызывая введение первого комплементарного 5′-рибонуклеозидтрифосфата. Помните, что каждое нуклеотидное основание ДНК имеет комплемент: аденин и тимин, а также гуанин и цитозин. Однако комплементы рибонуклеотидных оснований немного различаются, поскольку РНК не содержит тимин, а содержит урацил, поэтому комплементом аденина является урацил.После введения первого комплементарного 5′-рибонуклеотида последующие комплементарные рибонуклеотиды вставляются в направлении от 5′ к 3′. Эти рибонуклеотиды соединены фосфодиэфирными связями, и на этой стадии молекулы ДНК и РНК все еще связаны (см. рис. 1).

    Источник изображения: Википедия

    Рисунок 1: Инициация транскрипции. RNAP® относится к РНК-полимеразе.

    Удлинение цепи происходит, когда субъединица σ диссоциирует от цепи ДНК, позволяя растущей цепи РНК отделиться от цепи ДНК-матрицы.Этому способствует основной фермент (см. рис. 2).

    Источник изображения: Википедия

    Рисунок 2: Элонгация при транскрипции

    Терминация происходит, когда основной фермент встречает последовательность терминации , которая представляет собой специфическую последовательность нуклеотидов, которая действует как сигнал для остановки транскрипции. В этот момент транскрипт РНК образует вторичную структуру шпильки , сворачиваясь сам с собой с помощью водородных связей.Терминации у прокариот может способствовать дополнительный фактор терминации, известный как rho(ρ) . Терминация завершается, когда молекула РНК высвобождается из цепи матричной ДНК. У эукариот терминация требует дополнительной стадии, известной как полиаденилирование у эукариот, когда к цепи РНК добавляется хвост из нескольких аденозинмонофосфатов.

    Рисунок 3: Основные события на каждой стадии транскрипции

    Что такое обратная транскрипция?

    Обратная транскрипция — это процесс транскрибирования молекулы ДНК с молекулы РНК.Этот метод репликации используется ретровирусами , такими как ВИЧ, и производит измененную ДНК, которая может быть включена непосредственно в клетку-хозяин, что обеспечивает быстрое размножение. Это стало возможным благодаря ферменту обратной транскриптазы . Это видно на рисунке 4.

    Источник изображения: Википедия

    Рисунок 4: Процесс обратной транскрипции.

    Что такое перевод?

    Перевод относится к преобразованию чего-либо с одного языка или формы на другой.В биологии трансляция — это процесс, посредством которого матричная рибонуклеиновая кислота или мРНК синтезирует белки — мРНК превращается в белки. Это достигается за счет образования цепочки аминокислот (полипептидной цепи), определяемой химической информацией, хранящейся в конкретной цепи мРНК. Эти полипептиды складываются, образуя белки. Каждая цепь мРНК кодируется другим геном и кодирует другой белок. Это важно для экспрессии генов.

    Источник изображения: Wikimedia Commons

    Рисунок 5: Триплетный код транслируется в аминокислоты, некоторые аминокислоты кодируют начало и конец трансляции

    Трансляция состоит из трех основных стадий: инициации, элонгации и терминации.Они немного различаются у прокариотических и эукариотических организмов: у прокариот трансляция происходит в цитоплазме, а у эукариот трансляция происходит в эндоплазматическом ретикулуме. Существенным для процесса трансляции является рибосома; Структура рибосом также различается у прокариот и эукариот, в основном в отношении скорости миграции их субъединиц при центрифугировании и количества белков, содержащихся в их субъединицах.

    Инициация начинается с того, что малая субъединица рибосомы связывается с 5′-концом мРНК, матричной РНК, созданной в результате транскрипции из ДНК.Это происходит в два этапа: малая рибосомная субъединица сначала связывается с несколькими белковыми факторами инициации , прежде чем комбинированная структура связывается с мРНК. Этот сайт связывания находится за несколько рибонуклеотидов до стартового кодона мРНК. После этого заряженная молекула тРНК связывается с малой субъединицей рибосомы. Затем большая субъединица рибосомы связывается с комплексом, образованным малой субъединицей рибосомы, мРНК и тРНК. Этот процесс гидролизует GTP (гуанозин-5′-трифосфат), необходимый для питания связей.После присоединения большой рибосомной субъединицы к комплексу высвобождаются факторы инициации.

    Зарядка молекулы тРНК, используемая в процессе трансляции, относится к связыванию молекулы тРНК с аминокислотой. Это происходит в результате действия аминоацил-тРНКсинтетаз , которые реагируют с аминокислотой и АТФ (аденозинтрифосфатом) с образованием реактивной формы аминокислоты, известной как аминоациладениловая кислота . Он связывается с АТФ с образованием комплекса, который может реагировать с молекулой тРНК, образуя ковалентную связь между ними.Теперь тРНК может переносить аминокислоту в молекулу мРНК.

    Элонгация начинается, когда малая и большая субъединицы рибосом связаны с мРНК. На молекуле мРНК образуются пептидильный и аминоацильный сайты для дальнейшего связывания с тРНК. Сначала тРНК связывается с Р-сайтом (пептидил-сайт), а удлинение начинается со связыванием второй молекулы тРНК с А-сайтом (аминоацил-сайт). Обе эти молекулы тРНК транспортируют аминокислоты. Фермент, известный как пептидилтрансфераза, высвобождается и образует пептидную связь между аминокислотами, транспортируемыми двумя молекулами тРНК.Ковалентная связь между молекулой тРНК в P-сайте и ее аминокислотой разрывается, и эта тРНК высвобождается в E-сайте (сайте выхода) до того, как она полностью высвобождается из молекулы мРНК. ТРНК, расположенная в сайте А, затем перемещается в сайт Р, используя энергию, вырабатываемую ГТФ. Это оставляет сайт A свободным для дальнейшего связывания, в то время как сайт P содержит молекулу тРНК, присоединенную к аминокислоте , которая присоединена к другой аминокислоте . Это составляет основу полипептидной цепи.Затем другая молекула тРНК связывается с сайтом А, и пептидилтрансфераза катализирует создание пептидной связи между этой новой аминокислотой и аминокислотой, присоединенной к тРНК, расположенной в сайте Р. Ковалентная связь между аминокислотой и тРНК в Р-сайте разрывается, и тРНК высвобождается. Этот процесс повторяется снова и снова, добавляя аминокислоты к полипептидной цепи.

    Терминация происходит, когда рибосомный комплекс встречает стоп-кодон (см. рис. 5).На этой стадии полипептидная цепь присоединяется к тРНК в P-сайте, а A-сайт не присоединяется. GTP-зависимые факторы высвобождения разрывают связь между конечной тРНК и терминальной аминокислотой. ТРНК высвобождается из рибосомного комплекса, который затем снова расщепляется на малую и большую рибосомные субъединицы, которые высвобождаются из цепи мРНК. Затем эта полипептидная цепь сворачивается сама по себе, образуя белок. Этот процесс показан на рис. 6 и рис. 7.

    Источник изображения: Википедия

    Рисунок 6: Обзор процесса перевода

    Рисунок 7: Основные события на каждом этапе перевода.

    Чем перевод отличается от транскрипции?

    И транскрипция, и трансляция одинаково важны в процессе потока генетической информации внутри клетки, от генов в ДНК до белков. Ни один процесс не может происходить без другого. Однако в этих процессах есть несколько важных отличий.

    Начнем с того, что начальные компоненты транскрипции включают ДНК, основной фермент РНК-полимеразы и σ-субъединицу. Компоненты трансляции включают мРНК, малые и большие субъединицы рибосом, факторы инициации, факторы элонгации и тРНК.При транскрипции двойная спираль ДНК денатурируется, чтобы позволить ферменту получить доступ к цепи матрицы. При трансляции такая денатурация не требуется, поскольку матрица представляет собой одну цепь мРНК. Продуктом транскрипции является РНК, которая может встречаться в форме мРНК, тРНК или рРНК, а продуктом трансляции является полипептидная аминокислотная цепь, образующая белок.

    Транскрипция происходит в ядре эукариотических организмов, тогда как трансляция происходит в цитоплазме и эндоплазматическом ретикулуме.Оба процесса происходят в цитоплазме прокариот. Фактором, контролирующим эти процессы, является РНК-полимераза при транскрипции и рибосомы при трансляции. При транскрипции эта полимераза перемещается по матричной цепи ДНК, а при трансляции комплекс рибосома-тРНК перемещается по цепи мРНК.

    Эти различия приведены в Таблице 1 ниже.

    Таблица 1: Различия между транскрипцией и трансляцией

      Транскрипция Перевод
    Компоненты ДНК, коровый фермент РНК-полимеразы, σ-субъединица мРНК, малая и большая субъединицы рибосомы, факторы инициации, факторы элонгации, тРНК
    Шаблон ДНК мРНК
    Конечный продукт РНК Белок
    Местоположение (эукариоты/прокариоты) Ядро/цитоплазма Эндоплазматический ретикулум/цитоплазма
    Контролирующий фактор РНК-полимераза Рибосомы
    Действие РНК-полимераза реагирует с матричной цепью ДНК Рибосомный комплекс взаимодействует с цепью мРНК

    Несмотря на свою мощь, ДНК так же хороша, как и ее продукты.Именно по этой причине так важны процессы транскрипции и трансляции. Для бесперебойной работы клеточных процессов как последовательности ДНК, так и их продукты должны работать по плану. Именно здесь транскрипция и трансляция вступают в игру и выполняют жизненно важную функцию ДНК.

    Давайте применим все на практике. Попробуйте этот практический вопрос по биологии:

    Хотите узнать больше о биологии?

    Ознакомьтесь с другими нашими статьями по биологии.

    Вы также можете найти тысячи практических вопросов на Albert.io. Albert.io позволяет вам настроить учебный процесс так, чтобы он ориентировался на практику, в которой вам больше всего нужна помощь. Мы дадим вам сложные практические вопросы, которые помогут вам достичь мастерства в биологии.

    Начните тренироваться здесь .

    Вы учитель или администратор, заинтересованный в повышении успеваемости учащихся по биологии?

    Узнайте больше о наших школьных лицензиях здесь .

    Понимание процессов трансляции — AP Biology

    Если вы считаете, что контент, доступный с помощью Веб-сайта (как это определено в наших Условиях обслуживания), нарушает одно или более ваших авторских прав, пожалуйста, сообщите нам, предоставив письменное уведомление («Уведомление о нарушении»), содержащее в информацию, описанную ниже, назначенному агенту, указанному ниже. Если университетские наставники примут меры в ответ на ан Уведомление о нарушении, он предпримет добросовестную попытку связаться со стороной, предоставившей такой контент средства самого последнего адреса электронной почты, если таковой имеется, предоставленного такой стороной Varsity Tutors.

    Ваше Уведомление о нарушении может быть направлено стороне, предоставившей контент, или третьим лицам, таким как в виде ChillingEffects.org.

    Обратите внимание, что вы будете нести ответственность за ущерб (включая расходы и гонорары адвокатов), если вы существенно искажать информацию о том, что продукт или деятельность нарушают ваши авторские права. Таким образом, если вы не уверены, что содержимое находится на Веб-сайте или на который ссылается Веб-сайт, нарушает ваши авторские права, вам следует сначала обратиться к адвокату.

    Чтобы подать уведомление, выполните следующие действия:

    Вы должны включить следующее:

    Физическая или электронная подпись владельца авторских прав или лица, уполномоченного действовать от его имени; Идентификация авторских прав, которые, как утверждается, были нарушены; Описание характера и точного местонахождения контента, который, как вы утверждаете, нарушает ваши авторские права, в \ достаточно подробно, чтобы преподаватели университета могли найти и точно идентифицировать этот контент; например, мы требуем а ссылку на конкретный вопрос (а не только название вопроса), который содержит содержание и описание к какой конкретной части вопроса — изображению, ссылке, тексту и т. д. — относится ваша жалоба; Ваше имя, адрес, номер телефона и адрес электронной почты; и Заявление от вас: (а) что вы добросовестно полагаете, что использование контента, который, как вы утверждаете, нарушает ваши авторские права не разрешены законом или владельцем авторских прав или его агентом; б) что все информация, содержащаяся в вашем Уведомлении о нарушении, является точной, и (c) под страхом наказания за лжесвидетельство вы либо владельцем авторских прав, либо лицом, уполномоченным действовать от их имени.

    Отправьте жалобу нашему назначенному агенту по адресу:

    Чарльз Кон Varsity Tutors LLC
    101 S. Hanley Rd, Suite 300
    Сент-Луис, Миссури 63105

    Или заполните форму ниже:

     

    Трансляция – Биология Определение трансляции

    Трансляция Определение

    Трансляция относится к процессу создания белков из матрицы мРНК.Последовательность нуклеотидов на РНК транслируется в аминокислотную последовательность белков, и эта реакция осуществляется рибосомами. Рибосомы и тРНК стыкуются со зрелым транскриптом мРНК и задействуют множество ферментов в энергоемком процессе, в котором используются как АТФ, так и ГТФ.

    Генетический код

    Когда нуклеиновые кислоты были открыты в качестве первичного генетического материала, на первый план вышел один важный вопрос. В нуклеиновых кислотах всего 4 основания, тогда как белки состоят из 20 аминокислот.Следовательно, невозможно иметь прямую взаимооднозначную корреляцию между последовательностями нуклеотидов и аминокислот. Даже наличия двух нуклеотидов, кодирующих одну аминокислоту, недостаточно. Поэтому было высказано предположение, что аминокислоты кодируются участками из трех нуклеотидов, называемыми кодонами. Серия экспериментов 1960-х годов подтвердила эту гипотезу, а также показала, что эти кодоны не перекрываются друг с другом. Кроме того, поскольку участки из 3 нуклеотидов могут давать в общей сложности 64 кодона, одна аминокислота может кодироваться несколькими кодонами, что называется «вырожденностью».Часто разница между вырожденными кодонами заключается в третьем основании, которое называется «положением колебания». Например, аминокислота серин может кодироваться шестью кодонами, четыре из которых: UCA, UCG, UCU или UCC. Точно так же фенилаланин может быть представлен либо UUU, либо UUC на мРНК, а лейцин кодируется всего шестью кодонами. Этому вырождению способствует тот факт, что третий нуклеотид в каждом кодоне слабо связывается с соответствующей ему тРНК, позволяя основаниям необычного типа соединяться друг с другом.

    Из 64 кодонов, образованных различными комбинациями 4 нуклеотидов, 3 являются стоп-кодонами, сигнализирующими об окончании трансляции. Это UAA, UAG и UGA, которые распознаются белками, называемыми факторами высвобождения, а не тРНК. Когда рибосома сталкивается со стоп-кодоном, она диссоциирует от мРНК за счет ферментативного действия факторов высвобождения.

    Нетранслируемые области мРНК

    Весь участок зрелой мРНК не состоит из кодонов, которые транслируются в аминокислотную последовательность белка.На 5′-конце РНК есть «кэп», два коротких участка нетранслируемых регуляторных областей, примыкающие к кодирующей последовательности (5′-UTR и 3′-UTR), и полиаденилатный хвост, который может определять последовательность белка без прямой трансляции. .

    Эти области участвуют в экспорте мРНК из ядра, защите от ферментативной деградации и регуляции трансляционной активности. Они содержат сайты связывания белков, которые могут усиливать или ослаблять трансляцию, сайты стыковки рибосом и других частей механизма трансляции, а также ферменты, которые катализируют деградацию мРНК при удовлетворении потребности клетки в белке.

    Структура и функция тРНК

    Транспортные РНК действуют как адаптерные молекулы между мРНК и аминокислотами, доставляя соответствующую аминокислоту к рибосоме на основе кодонов мРНК. тРНК содержат антикодон из трех оснований, который может распознавать и связываться с мРНК, а также действовать как сигнал для правильной аминокислоты. Последовательность антикодона комплементарна кодону мРНК и проходит в антипараллельном направлении, позволяя двум молекулам образовывать пары оснований друг с другом.

    Группа ферментов, называемых аминоацил-тРНК-синтетазами, присоединяет соответствующую аминокислоту к молекулам тРНК на основе их антикодона.Для каждой из 20 аминокислот существует одна аминоацил-тРНК-синтетаза, и этот фермент может распознавать все антикодоны, представляющие эту конкретную аминокислоту. Эти ферменты используют энергию АТФ для присоединения аминокислоты к последнему нуклеотиду на 3′-конце тРНК. Теперь тРНК считается «заряженной» и может участвовать в реакциях синтеза белка на рибосоме.

    Структура и функция рибосом

    Рибосомы представляют собой макромолекулярные многосубъединичные структуры, содержащие РНК, а также белок, и являются основными механизмами, управляющими синтезом белка.Структура рибосомы в первую очередь определяется ее компонентом РНК (рибосомной РНК или рРНК), и спаривание оснований с мРНК и тРНК имеет решающее значение для ее функции.

    Рибосома содержит две субъединицы, и трансляция инициируется, когда меньшая субъединица связывается с последовательностями, расположенными выше кодирующей последовательности на мРНК. Прокариотическая трансляция начинается с непосредственного связывания рРНК с мРНК, тогда как в эукариотической трансляции участвуют другие белки, называемые факторами инициации. Меньшая субъединица вместе с некоторыми другими белками рекрутирует большую субъединицу рибосомы, и начинается трансляция.

    Прежде всего, рибосома содержит три важных участка — сайт P, сайт A и сайт E — образованные трехмерной формой рРНК. Сайт P связывается с растущим полипептидом, сайт A закрепляет входящую заряженную тРНК, и после образования пептидной связи тРНК ненадолго связывается с сайтом E, прежде чем покинуть рибосому.

    Механизм трансляции

    Трансляция протекает в три этапа – инициация, удлинение и терминация. Каждый из них связан с разными белками, и на каждом этапе АТФ и ГТФ используются в качестве источников энергии.

    Одна мРНК может транслироваться несколькими рибосомами в процессе, называемом транслатомом. Эти комплексы первоначально назывались эргосомами, а теперь называются полисомами или полирибосомами.

    Инициация

    Трансляция начинается с того, что транскрипт зрелой мРНК экспортируется из ядра, а его 5′-кэп распознается меньшей субъединицей рибосомы. Рибосомная субъединица вместе со специальной тРНК сканирует мРНК, чтобы найти стартовый сайт для трансляции, которым часто является AUG — кодон метионина.Последовательности вокруг стартового кодона AUG также важны и могут определять, насколько сильно транслируется мРНК. Инициация также связана с активностью ряда вспомогательных белков, называемых факторами инициации, функция которых состоит в том, чтобы обеспечить упорядоченное взаимодействие различных частей механизма трансляции.

    Рибосома и инициирующая тРНК медленно перемещаются вдоль мРНК до тех пор, пока не будет обнаружен стартовый кодон. Структурные особенности этой тРНК гарантируют, что она распознается факторами инициации и дискриминируется факторами элонгации трансляции.Метионин, присоединенный к этой тРНК, также адаптирован для исключительной инициации — аминогруппа модифицирована для образования N-формилметионина, предотвращая его участие в фазе элонгации трансляции.

    Как только более крупная субъединица рибосомы достигает места начала трансляции, а тРНК располагается в своем P-сайте, инициация считается завершенной.

    Элонгация

    Связывание инициирующей тРНК с Р-сайтом рибосомы приводит к тесному контакту с амино- или А-сайтом рибосомы, где следующий кодон ожидает трансляции.Новые тРНК, несущие аминокислоты, входят в рибосому в А-сайте. Благодаря комплементарному спариванию оснований и энергии одной молекулы GTP правильная тРНК связывается с рибосомой. Затем рибосомная РНК катализирует образование пептидной связи между первой и второй аминокислотами, где первый метионин, по-видимому, «переносится» на тРНК в А-сайте. После образования пептидной связи пустая тРНК выходит из рибосомы, а сама рибосома перемещается вперед ровно на один кодон, так что тРНК с А-сайта перемещается в Р-сайт.Это также открывает следующий кодон для сайта А, готового для третьей тРНК. Этот процесс продолжается до тех пор, пока не будет достигнут стоп-кодон.

    Терминация

    Когда стоп-кодон присутствует в А-сайте, он распознается набором белков, называемых факторами высвобождения. Они побуждают рибосому присоединять к растущей полипептидной цепи молекулу воды, а не другую аминокислоту. Это завершает процесс трансляции и высвобождает полипептид из рибосомы. Две субъединицы рибосомы также диссоциируют друг от друга, готовые к следующему циклу трансляции.

    Трансляция в эндоплазматическом ретикулуме

    Трансляция может происходить либо на свободных рибосомах в цитоплазме, либо на рибосомах, присутствующих на поверхности эндоплазматического ретикулума (ЭР). Трансляция начинается в цитоплазме почти для всех белков. Однако белки, которые необходимы в качестве белков внутренней мембраны или те, которые необходимо секретировать из клетки, являются мишенями для дальнейшей трансляции на ER. Эти белки содержат короткий участок гидрофобных остатков, называемый сигнальным пептидом, в начале своей последовательности.Как только эти остатки транслируются, сигнальный пептид распознается специфическими белками, называемыми частицами распознавания сигнала, которые могут транспортировать всю рибосому и ассоциированные молекулы к мембране ЭР. Сигнальный пептид встраивается в мембрану ЭР, а остальная часть белка высвобождается во внутреннее пространство ЭР. Сигнальный пептид удаляется из белков, которые необходимо секретировать из клетки, в то время как те, которые предназначены для внутренних мембран, сохраняют этот короткий участок, обеспечивая мембранный якорь.

    Иногда белки, необходимые внутри таких органелл, как митохондрии и хлоропласты, транслируются в цитоплазму. Эти белки избирательно транспортируются в эти органеллы с использованием специфических белков в энергоемком процессе.

    Антибиотики-мишени

    Различия между прокариотическими и эукариотическими механизмами трансляции делают их идеальными лекарственными мишенями для борьбы с инфекциями, при этом клетки организма остаются нетронутыми. Эти антибиотики включают хлорамфеникол, тетрациклин, пуромицин и эритромицин.Однако, поскольку большинство животных также содержат богатый внутренний биом симбиотических бактерий, эти антибиотики также могут вызывать ряд побочных эффектов, включая дефицит витаминов.

    • Ориентация 3′ -> 5′ – Направленность одной нити нуклеиновой кислоты, определяемая нумерацией атомов углерода в нуклеотидном сахарном кольце. Один конец нуклеиновой кислоты имеет свободную гидроксильную группу на третьем углероде, а другой конец имеет свободную фосфатную группу, присоединенную к пятому углероду.
    • Антипараллельная ориентация – Два биополимера, которые идут параллельно друг другу, но в противоположных ориентациях. Две нити ДНК антипараллельны друг другу в отношении ориентации их сахаро-фосфатных остовов.
    • Энергетическая валюта клетки – Небольшие нуклеотиды, содержащие высокоэнергетические связи, которые используются для хранения и высвобождения энергии внутри клетки. АТФ и ГТФ являются обычными энергетическими валютами в клетке.
    • Грубый эндоплазматический ретикулум – Эндоплазматический ретикулум, усеянный рибосомами, в которых транслируются белки, предназначенные для внутренних мембран или секреции.

    Тест

    1. Какой из этих кодонов кодирует серин?
    A. UCA
    B. UAA
    C. UAG
    D. Все вышеперечисленное

    Хотя серин может кодироваться несколькими кодонами, четыре из них отличаются друг от друга только третьей позицией или позицией колебания. Поэтому UCA, UCC, UCG и UCU кодируют серин. UAA и UAG — стоп-кодоны.

    2. Какой из этих ферментов участвует в трансляции?
    A. AminoCyl TRNA Synthetase
    B. 23s RRNA
    C. Peptidyl Transferradase
    D. Все вышеперечисленное

    Ответ на вопрос # 2

    D правильный.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.