Проверка тиц и pr: Проверка позиций сайта в поисковиках

ASP.NET Framework

Технологический стек, необходимый для хостинга веб-сайта

Диспетчер тегов Google

Используется для загрузки скриптов на страницы сайта.

Google Analytics

Google Analytics собирает информацию о веб-сайтах, позволяя нам понять, как вы взаимодействуете с нашим веб-сайтом, и, в конечном итоге, обеспечить лучший опыт.

Имя файла cookie:

• _ga

  Регистрирует уникальный идентификатор, который используется для генерации статистических данных о том, как посетитель использует веб-сайт.
  Срок действия: 2

  лет
• _gid

  Регистрирует уникальный идентификатор, который используется для генерации статистических данных о том, как посетитель использует веб-сайт.
  Срок действия: 24 часы

• NID

  Cookie содержит уникальный идентификатор, который Google использует для запоминания ваших предпочтений и другой информации, например, предпочитаемого вами языка (например. грамм. Английский), сколько результатов поиска вы хотите отображать на странице (например, 10 или 20) и хотите ли вы, чтобы фильтр безопасного поиска Google был включен.
  Срок действия: 2

  лет
• _gat_UA — ######## — #

  Используется для ограничения частоты запросов. Если Google Analytics развернут через Диспетчер тегов Google, этот файл cookie будет называться _dc_gtm_
  Expiration: 1 минута

• _gac_ <идентификатор-свойства>

  Содержит информацию о кампании для пользователя.Если вы связали свои учетные записи Google Analytics и AdWords, теги конверсии веб-сайта AdWords будут считывать этот файл cookie, если вы не отключите их.
  Срок действия: 90 дней

• AMP_TOKEN

  Содержит токен, который можно использовать для получения идентификатора клиента из службы идентификатора клиента AMP. Другие возможные значения указывают на отказ, запрос в полете или ошибку при получении идентификатора клиента из службы идентификаторов клиентов AMP
  Срок действия: 1 год

Titan Consent Manager

Используется для отслеживания настроек конфиденциальности и согласия конечных пользователей на веб-сайтах, размещенных на Titan CMS.

Имя файла cookie:

• TitanClientID

  Однозначно идентифицирует пользователя для поддержки исторического отслеживания предпочтений согласия
  Истечение срока: 10

  лет
• CookieConsent_

  Отражает самые последние настройки согласия для текущего сайта.
  Срок действия: 2

  лет

Поиск IP

Эти файлы cookie используются Magnaflux для направления пользователей на веб-сайт Magnaflux для их конкретной страны. Это делается автоматически.

Пардо

Для наших веб-сайтов, которые содержат веб-формы или отслеживание Pardot, мы собираем информацию о страницах, которые вы посещаете, о том, как долго вы находитесь на сайте, как вы сюда попали и на что нажимаете.Pardot помогает Magnaflux обеспечить беспроблемный пользовательский интерфейс для тех клиентов и пользователей, которые создали у нас учетную запись для получения сообщений электронной почты.

Имя файла cookie:

• visitor_id #

  Однозначно идентифицирует пользователя
  Срок действия: 10

  лет
• visitor_id # -HASH

  Однозначно идентифицирует пользователя
  Срок действия: 10

  лет
• pi_opt_in

  Флаг согласия на получение личной информации
  Истечение срока: 10

  лет
• ИПВ

  Неклассифицированный
  Срок действия: Сессия

• Пардо

  Неклассифицированный
  Срок действия: Сессия

• dtCookie

  Неклассифицированный
  Срок действия: Сессия

Поисковые запросы

Для наших веб-сайтов, которые содержат поисковые запросы по пакету переводов, мы устанавливаем файл cookie, в котором хранится используемый поисковый запрос.

Отслеживание Google AdSense

Google использует файлы cookie для обслуживания рекламы, отображаемой на веб-сайтах своих партнеров, таких как веб-сайты, показывающие рекламу Google или участвующие в рекламных сетях, сертифицированных Google. Когда пользователи посещают веб-сайт партнера Google, в браузере этого конечного пользователя может быть сохранен файл cookie.

Имя файла cookie:

• IDE

  Используется Google для регистрации и сообщения о действиях пользователя веб-сайта после просмотра или нажатия одной из рекламных объявлений рекламодателя с целью измерения эффективности рекламы и представления целевой рекламы пользователю.
  Срок действия: 6 мес

• NID

  Неклассифицированный
  Срок действия: 6 мес

• DSID

  Неклассифицированный
  Срок действия: Сессия

Отслеживание Google AdSense

Собирает данные для измерения эффективности просмотренных или нажатых объявлений и показывает таргетированные объявления.

Имя файла cookie:

• г / сбор

  Неклассифицированный
  Срок действия: 6 мес

• IDE

  Используется Google DoubleClick для регистрации и сообщения о действиях пользователя веб-сайта после просмотра или нажатия на одно из объявлений рекламодателя с целью измерения эффективности объявления и представления пользователю целевой рекламы.
  Срок действия: 1 год

• test_cookie

  Используется для проверки, поддерживает ли браузер пользователя файлы cookie.
  Срок действия: Сессия

Аутентификация Titan CMS

Технологический стек, необходимый для хостинга веб-сайта

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Счетчики жидких частиц — Системы измерения частиц

Только системы измерения частиц имеют лучшую в отрасли чувствительность 20 нм.

Будь то производство полупроводников, авиации, фармацевтики или чувствительных компонентов, контроль чистоты как воздуха, так и жидкости является требованием для поддержания высокого качества продукции с максимальным выходом. Компания Particle Measuring Systems производит оборудование для измерения частиц в соответствии с высочайшими отраслевыми стандартами и особенно подходит для обеспечения точного контроля в чистых помещениях.

Наши ведущие в отрасли счетчики жидких частиц обеспечивают надежный подсчет частиц в воде DI и UPW, а также в химикатах до 20 нм. Выберите из множества диапазонов чувствительности и среды, чтобы найти правильное решение для вашего приложения.

Счетчики жидких частиц необходимы для критического измерения сверхчистой воды и технологических химикатов в полупроводниковой и других отраслях обрабатывающей промышленности. Будь то производство полупроводников, авиации, фармацевтики или чувствительных компонентов — мониторинг загрязнения как в воздухе, так и в жидкости является требованием для поддержания высокого качества продукции с максимальным выходом. Системы измерения частиц (PMS) производят оборудование для контроля частиц, отвечающее самым высоким отраслевым стандартам, и особенно подходит для обеспечения точного контроля в чистых помещениях.

Счетчик частиц обнаруживает физические частицы, присутствующие как в сверхчистой воде, так и в технологических химикатах высокой чистоты. Контроль загрязнения в этих критических жидких технологических потоках имеет важное значение для повышения урожайности. Счетчики критических жидких частиц необходимы для разработки чистых химических и водных систем, а также для поддержания этих систем в чистой производственной среде.

могут применяться в различных областях, связанных с чистыми средами. Наши счетчики жидких частиц могут определять размер, количество и природу частиц в жидких подложках, компьютерных компонентах, медицинских устройствах, чувствительном оборудовании или ряде других прецизионных устройств.Системы подсчета жидких частиц также могут определять общее качество жидкого субстрата; как количество, так и размер твердых частиц важны для определения чистоты чистящих растворов, жидких фармацевтических продуктов, пищевых продуктов, масел, топлива и смазочных материалов или различных других систем, в которых необходимо предотвратить загрязнение.

Счетчики жидких частиц используются в различных областях чистого производства. В сочетании с нашей глобальной командой экспертов по применению мы можем помочь вам контролировать загрязнение в различных областях и местах, включая:

• встроенный контроль жидких частиц
• Обеспечение химического качества в системах распределения, доставки или упаковки
• отбор проб из партии химикатов
• Контроль точки процесса
• Проверка работоспособности компонентов для работы с химическими веществами
• Количественное определение концентрации частиц в современных системах сверхчистой воды (UPW)
• Анализ тенденций
• Обнаружение роста бактерий в системах UPW
• Отслеживание эпизодических событий и сигнализация
• Непрерывный мониторинг системы
• Управление производственным процессом
• Иммерсионная литография
• Измерение уровня частиц в шипучих жидкостях
• Контроль процесса ванн для очистки пластин
• Отбор проб емкостей для очистки деталей
• Фармацевтический парентеральный мониторинг U. Стандарты S., EP, JP и FDA
• Проверка чистоты деталей / медицинского оборудования
• Лабораторный отбор проб воды для анализа очищенной воды и воды для инъекций (WFI)
• Проверка эффективности фильтра

Наши ведущие в отрасли счетчики жидких частиц обеспечивают надежный подсчет частиц в воде DI и UPW, а также в химикатах до 20 нм. Выберите из множества диапазонов чувствительности и среды, чтобы найти правильное решение для вашего приложения.

Без эффективного измерения загрязнения невозможно надлежащий контроль жидких процессов.Системы измерения частиц (PMS) стремятся установить отраслевой стандарт для технологии мониторинга частиц, обеспечивая беспрецедентный контроль, качество и надежность нашего оборудования для чистых помещений.

Позвоните нам сегодня
Без надлежащих измерений надлежащий контроль за состоянием чистых помещений невозможен. Системы измерения частиц (PMS) стремятся установить отраслевой стандарт для технологий чистых помещений, гарантируя беспрецедентный контроль, качество и надежность нашего оборудования для чистых помещений.

Чтобы узнать больше о том, как PMS может обеспечить инновации, расширение возможностей и целостность средств управления чистыми помещениями, посетите наши предстоящие веб-семинары, зарегистрируйтесь в колледже частиц или свяжитесь с одним из наших местных офисов.

Вдыхаемые твердые частицы и здоровье (PM2,5 и PM10)

Что такое твердые частицы?

Переносимые по воздуху твердые частицы (ТЧ) не являются отдельным загрязнителем, а представляют собой смесь многих химических веществ. Это сложная смесь твердых частиц и аэрозолей, состоящая из мелких капель жидкости, сухих твердых фрагментов и твердых ядер с жидкими покрытиями.Частицы сильно различаются по размеру, форме и химическому составу и могут содержать неорганические ионы, соединения металлов, элементарный углерод, органические соединения и соединения земной коры. В целях регулирования качества воздуха частицы определяются по их диаметру. Те, что имеют диаметр 10 микрон или меньше (PM10), попадают в легкие и могут вызывать неблагоприятные последствия для здоровья. Мелкие твердые частицы определяются как частицы диаметром 2,5 микрона или менее (PM2,5). Следовательно, PM2,5 включает часть PM10.

В чем разница между PM10 и PM2,5?

PM10 и PM2,5 часто образуются из разных источников выбросов, а также имеют разный химический состав. Выбросы от сжигания бензина, масла, дизельного топлива или древесины производят большую часть загрязнения PM2,5, обнаруженного в наружном воздухе, а также значительную долю PM10. PM10 также включает пыль со строительных площадок, свалок и сельского хозяйства, лесные пожары и сжигание кустарников / мусора, промышленные источники, переносимую ветром пыль с открытых земель, пыльцу и фрагменты бактерий.

ТЧ могут либо напрямую выбрасываться из источников (первичные частицы), либо образовываться в атмосфере в результате химических реакций газов (вторичных частиц), таких как диоксид серы (SO ₂ ), оксиды азота (NO _X ) и некоторые органические соединения. Эти органические соединения могут выделяться как из естественных источников, таких как деревья и растительность, так и из искусственных (антропогенных) источников, таких как промышленные процессы и выхлопные газы транспортных средств. Относительные размеры PM10 и PM2.5 частиц сравниваются на рисунке ниже.

Почему CARB беспокоятся о PM10 и PM2,5?

CARB обеспокоен переносимыми по воздуху частицами из-за их воздействия на здоровье жителей Калифорнии и окружающую среду. И PM2,5, и PM10 можно вдыхать, при этом некоторое их количество откладывается в дыхательных путях, хотя места отложения частиц в легких зависят от размера частиц. PM2,5 с большей вероятностью попадет и откладывается на поверхности более глубоких частей легкого, в то время как PM10 с большей вероятностью откладывается на поверхности более крупных дыхательных путей верхней части легкого.Частицы, осевшие на поверхности легких, могут вызывать повреждение тканей и воспаление легких.

Какие виды вредных воздействий могут вызывать твердые частицы?

Ряд неблагоприятных воздействий на здоровье был связан с воздействием как PM2,5, так и PM10. Кратковременное воздействие PM2,5 (продолжительностью до 24 часов) было связано с преждевременной смертностью, увеличением количества госпитализаций по причинам, связанным с сердцем или легкими, острым и хроническим бронхитом, приступами астмы, посещениями пунктов неотложной помощи, респираторными симптомами и ограничениями. дни активности.Об этих неблагоприятных последствиях для здоровья сообщалось в основном у младенцев, детей и пожилых людей с ранее существовавшими заболеваниями сердца или легких. Кроме того, из всех распространенных загрязнителей воздуха PM2,5 связаны с наибольшей долей неблагоприятных последствий для здоровья, связанных с загрязнением воздуха, как в Соединенных Штатах, так и во всем мире, согласно проекту Всемирной организации здравоохранения «Глобальное бремя болезней».

Кратковременное воздействие PM10 было связано в первую очередь с обострением респираторных заболеваний, включая астму и хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), что привело к госпитализации и обращению в отделения неотложной помощи.

Долгосрочное (от месяцев до лет) воздействие PM2,5 было связано с преждевременной смертью, особенно у людей с хроническими заболеваниями сердца или легких, а также с замедлением роста функции легких у детей. Последствия длительного воздействия PM10 менее очевидны, хотя несколько исследований предполагают связь между долгосрочным воздействием PM10 и респираторной смертностью. Международное агентство по изучению рака (IARC) опубликовало в 2015 году обзор, в котором сделан вывод о том, что твердые частицы в загрязненном атмосферном воздухе вызывают рак легких.

Кто подвергается наибольшему риску от воздействия твердых частиц?

Исследования указывают на пожилых людей с хроническими заболеваниями сердца или легких, детей и астматиков как на группы, наиболее подверженные неблагоприятным последствиям для здоровья от воздействия PM10 и PM2.5. Кроме того, дети и младенцы подвержены вреду от вдыхания загрязнителей, таких как ТЧ, потому что они вдыхают больше воздуха на фунт веса тела, чем взрослые — они дышат быстрее, проводят больше времени на открытом воздухе и имеют меньшие размеры тела. Кроме того, незрелая иммунная система детей может сделать их более восприимчивыми к PM, чем здоровые взрослые.

Исследования, проведенные в рамках исследования здоровья детей, инициированного CARB, показали, что у детей, живущих в сообществах с высоким уровнем PM2,5, рост легких был медленнее, а легкие в возрасте 18 лет меньше, чем у детей, живущих в сообществах с низким уровнем PM2.5 уровней.

CARB использовал методологию оценки рисков Агентства по охране окружающей среды США для оценки преждевременной смертности, связанной с воздействием PM2,5 (California Air Resources Board 2010). Обновление этого анализа с использованием данных о качестве атмосферного воздуха за 2014–2016 годы показало, что воздействие PM2,5 приводит к 5400 (диапазон неопределенности 4200–6700) преждевременных смертей от сердечно-легочных причин в год в Калифорнии. Кроме того, PM2,5 способствует примерно 2800 госпитализациям по поводу сердечно-сосудистых и респираторных заболеваний (диапазон неопределенности 350–5100) и около 6700 обращений в отделения неотложной помощи по поводу астмы (диапазон неопределенности 4200–9300) каждый год в Калифорнии.

Как твердые частицы влияют на окружающую среду?

Во многих научных исследованиях было показано, что твердые частицы снижают видимость, а также отрицательно влияют на климат, экосистемы и материалы. ТЧ, в первую очередь ТЧ2,5, влияют на видимость, изменяя способ поглощения и рассеяния света в атмосфере. Что касается изменения климата, то некоторые компоненты окружающей смеси ТЧ способствуют потеплению климата (например, черный углерод), в то время как другие оказывают охлаждающее влияние (например.g., нитрат и сульфат), и поэтому атмосферные ТЧ обладают свойствами как для потепления климата, так и для охлаждения. ТЧ могут отрицательно влиять на экосистемы, включая растения, почву и воду из-за осаждения ТЧ и их последующего поглощения растениями или отложения в воду, где они могут повлиять на качество и прозрачность воды. Металлы и органические соединения в ТЧ обладают наибольшим потенциалом для изменения роста и урожайности растений. Осаждение ТЧ на поверхности приводит к загрязнению материалов.

Являются ли твердые частицы проблемой в помещении?

Некоторые твердые частицы, обнаруженные в помещении, образуются снаружи, особенно PM2.5. Эти частицы проникают в помещения через двери, окна и «протечки» в строительных конструкциях. Частицы также могут происходить из внутренних источников. Частицы внутреннего происхождения включают компоненты, полученные из биологических источников, многие из которых являются известными аллергенами, например пыльца, споры плесени, пылевые клещи и тараканы. Частицы также образуются в помещениях, включая курение табака, приготовление пищи и сжигание дров, свечей или благовоний. Частицы также могут образовываться в помещении в результате сложных реакций газообразных загрязнителей, выбрасываемых из таких источников, как бытовые чистящие средства и освежители воздуха.

Каковы стандарты качества окружающего воздуха для твердых частиц?

Стандарты качества окружающего воздуха определяют максимальное количество загрязняющих веществ, которые могут присутствовать в наружном воздухе без вреда для здоровья человека. В 2002 году, после обширного обзора научной литературы, Совет принял новый среднегодовой стандарт для PM2,5 ppm и сохранил существующие годовые и 24-часовые стандартные средние стандарты для PM10. Национальный ежегодный стандарт PM2,5 был в последний раз пересмотрен в 2012 году после исчерпывающего обзора новой литературы, указывающей на доказательства повышенного риска преждевременной смертности при более низких PM2.5 концентраций по сравнению с существующим стандартом. Обзор 2012 года привел к сохранению существующих суточных средних стандартов PM2,5 и PM10.

Тонущие частицы способствуют вертикальной связи в океаническом микробиоме. живая биомасса и биологическое разнообразие океана, одной из крупнейших экосистем на Земле.Погружение частиц в воду — это широко распространенный механизм, который переносит материалы в глубины океана, играющий важную роль в глобальном углеродном цикле. Является ли этот процесс глобальным путем распространения прокариотического разнообразия, соединяющего поверхностные сообщества с сообществами в темном океане, никогда не проверялось. Здесь мы показываем, что поверхностные и глубоководные сообщества прокариот тесно связаны, составляя обширное океаническое метасообщество, где местные сообщества связаны посредством переноса тонущих частиц.Это вертикальное рассредоточение, опосредованное в основном крупнейшими тонущими частицами, является фундаментальным процессом, формирующим сборку и биогеографию глубоководных океанических прокариотических сообществ.

Abstract

Погружение органических частиц, образующихся в фотическом слое, является основным вектором экспорта углерода в глубины океана. Хотя тонущие частицы сильно колонизированы микробами, до сих пор не изучалось, играет ли этот процесс роль в переносе прокариотического разнообразия с поверхности в глубинные слои океана.Используя секвенирование гена 16S рРНК Illumina, мы исследуем здесь вертикальную связность микробиома океана, охарактеризовав морские прокариотические сообщества, связанные с пятью фракциями разного размера, и изучив их композиционную изменчивость от поверхности до 4000 м на восьми станциях, отобранных в Атлантическом и Тихоокеанском регионах. и Индийские океаны во время экспедиции на Маласпина 2010. Наши результаты показывают, что самые многочисленные прокариоты в глубинах океана также присутствуют в поверхностных водах.Эта вертикальная связь сообществ, по-видимому, происходит преимущественно через самые большие частицы, потому что сообщества в фракциях самого большого размера показали самое высокое таксономическое сходство по всей толще воды, тогда как свободноживущие сообщества были более изолированы по вертикали. Наши результаты также предполагают, что процессы колонизации частицами, происходящие в поверхностных водах, в некоторой степени определяют состав и биогеографию батипелагических сообществ. В целом, мы постулируем, что тонущие частицы действуют как векторы, которые инокулируют жизнеспособные поверхностные микробы, прикрепленные к частицам, в глубоководную область, определяя в значительной степени структуру, функционирование и биогеографию глубоководных океанических сообществ.

Значительная часть органического углерода, образующегося на поверхности залитого солнцем океана в результате фотосинтеза, экспортируется в глубину океана в виде тонущих частиц (1, 2), поддерживая глобально значимый поток углерода, питающий обычно голодающие сообщества батипелагических микробов (3, 4) . Хотя углерод, достигающий темного океана, в конечном итоге контролируется активностью прокариотических сообществ, которые прикрепляются к этим частицам (5, 6), до сих пор ни одно исследование не исследовало, могут ли тонущие частицы также представлять собой векторы рассеивания жизнеспособного прокариотического разнообразия в глубинах океана. .

Частицы, образующиеся в поверхностных водах, быстро колонизируются прокариотами, и прикрепленные к частицам сообщества часто более метаболически активны (7⇓ – 9) и филогенетически разнообразны (например, ссылки 10⇓ – 12), чем взвешенные (свободноживущие) сообщества. . Хотя было показано, что связанные с частицами прокариотические сообщества меняются составом с глубиной (например, ссылки 13–15), неясно, являются ли эти изменения следствием экологической сукцессии таксонов на деградирующей частице (16) или непрерывной колонизация частиц во время погружения.Сборки, прикрепленные к тонущим частицам, могут влиять на структуру более глубоких прокариотических сообществ, если спящие или медленно растущие поверхностные таксоны процветают при достижении определенной глубины или при изменении природы частицы. В этом случае тонущие частицы обеспечат непрерывный приток жизнеспособных иммигрантов в глубокие океаны.

Оценка значимости такого процесса расселения потребовала бы сравнения сообществ, связанных с частицами, между поверхностными и батипелагическими водами, но это никогда не предпринималось, даже в локальных масштабах.В самом деле, вертикальная связь между сообществами от поверхности до батипелагических вод остается плохо изученной, потому что пространственные исследования, фокусирующиеся в вертикальном измерении, часто описывают сообщества с каждой глубины без оценки их потенциальных связей по всей толще воды (например, ссылки 17⇓ – 19). Только несколько недавних исследований показали, что сообщества из поверхностных и глубоких вод могут быть связаны посредством адвекции или опускания водных масс (20⇓ – 22), но они не учитывали роль опускающихся частиц как вектора, поддерживающего вертикальную связность.Кроме того, поскольку крупные частицы опускаются быстрее, чем мелкие частицы, которые могут даже оставаться плавучими (23⇓ – 25), сообщества, связанные с более крупными и быстро опускающимися частицами, вероятно, будут иметь больше шансов достичь самых глубоких слоев из-за более высоких скоростей рассеивания. Однако до настоящего времени большая часть литературы по прокариотам с прикрепленными частицами ограничивалась дихотомическим исследованием свободноживущих и прикрепленных популяций (например, ссылки 26–28), однако известно, что частицы встречаются в континууме размеров, которые могут быть колонизированы различными микробными популяциями (29).Кроме того, этот континуум размеров тесно связан с составом частицы, что также указывает на происхождение частицы: более крупные частицы моложе и более лабильны и образуются на поверхности (30), тогда как более мелкие частицы имеют тенденцию быть более старыми и устойчивыми. (31), возникающие в результате деградации более крупных частиц (32).

Учитывая, что происхождение и состав частиц в поверхностных водах различаются в пространстве (25, 33⇓ – 35), можно предположить, что структура микробного разнообразия в глубоком океаническом зеркале в некоторой степени связана с неоднородностью поверхности.Фактически, недавно было показано, что глубоководные сообщества, связанные с частицами, представляют гораздо более четкую биогеографию, чем их свободноживущие аналоги (36), но остаются ли эти закономерности локальными в глубоком море или переносятся с поверхности через тонущие частицы, остается неизученным. . Хотя важность гидрологически опосредованного распространения микробов для формирования местных сообществ была четко продемонстрирована в пресноводных экосистемах (37–39), а в последнее время и в океанических водах через движение водных масс (20–22, 40), роль частиц -зависимая вертикальная дисперсия в объяснении биогеографических структур глубоководных прокариот еще не была оценена.

Здесь мы исследуем, представляют ли тонущие частицы вектор распространения прокариот в глубинах океана, способствуя вертикальной связности морского микробиома, и проверяем гипотезу о том, что размер частиц влияет на вертикальную связность. Мы исследовали состав свободноживущих прокариотических сообществ, а также тех, которые прикреплены к частицам разного размера (от 0,8 до 200 мкм) на восьми станциях в глобальном тропическом и субтропическом океане, оценивая изменения в их составе с поверхности (3 м) до батипелагических вод (4000 м).В частности, мы проверяем гипотезу о том, что сообщества, прикрепленные к самым крупным частицам, демонстрируют сильное вертикальное сходство из-за предполагаемых более высоких скоростей опускания (т. Е. Более высокого рассредоточения) и что свободноживущие сообщества прокариот более различаются в толще воды, чем их вертикально связанные частицы. -прилагаемые аналоги. Более того, если часть тонущего разнообразия отделяется от частиц при достижении батипелагического слоя, становясь, таким образом, частью свободноживущего сообщества, процент прокариот, прикрепленных к частицам в поверхностных водах, также должен присутствовать как свободноживущие в батипелагическом слое. сообщества.Наконец, мы проверяем гипотезу о том, что если вертикальная связность является глобально значимым явлением, то глубоководные биогеографические модели должны напоминать модели сообществ, связанных с поверхностными частицами.

Результаты

Таксономический состав прокариотических сборок.

Мы исследовали станции, охватывающие широкий продольный градиент через тропический и субтропический Тихий, Атлантический и Индийский океаны ( SI Приложение , рис. S1 A ). Глубины, отобранные в пределах каждой станции, имели ярко выраженные вертикальные физико-химические и биологические вариации ( SI Приложение , рис.S1 B ). Соответственно, изученные прокариотические сообщества были четко структурированы вдоль водной толщи, различаясь в основном между фотической и афотической сферами, и имели также различные биогеографические признаки (рис.1 B и C и SI Приложение , таблица S1). . В то время как сообщества из самых крупных частиц (≥3,0 мкм) сгруппировались вместе независимо от глубины, сообщества из двух самых маленьких фракций сильно различались между поверхностными и более глубокими слоями (рис.1 A и B ). Следовательно, вертикальные различия сообществ были выше для фракции наименьшего размера (PERMANOVA R ² = 0,37, P <0,001), чем для фракций наибольшего размера ( R ² = 0,09, P = 0,597 ) ( SI Приложение , Таблица S2), тогда как горизонтальные различия, то есть между станциями, были выше в фракциях наибольшего размера ( R ² = 0,54, P <0.001), чем во фракции наименьшего размера ( R ² = 0,21, P <0,753) ( SI Приложение , Таблица S2). Как показывает RC _Bray (метрика Раупа-Крика, основанная на расстояниях Брея-Кертиса), наблюдаемые модели бета-разнообразия значительно отличались от ожидаемых случайно (т. Е. Экологический дрейф) примерно в 92% случаев [согласно Stegen et al. (41)], и это предполагает, что наблюдаемые паттерны бета-разнообразия генерировались другими процессами (такими как отбор и ограниченное или сильное рассредоточение), а не случайной сборкой сообщества (дрейфом).

ординации nMDS, представляющие пространственно расстояния Брея – Кертиса между изученными прокариотическими сообществами. Расстояния рассчитывались по разреженной таблице OTU. Образцы имеют цветовую кодировку в зависимости от фракции ( A ), глубины ( B ) и станции отбора проб ( C ).

Богатство операционных таксономических единиц (OTU) сильно варьировалось в зависимости от фракций размера и глубины (диапазон 136–1044 OTU на выборку, в среднем 580), но в целом богатство уменьшалось в сторону более крупных фракций на всех глубинах ( SI Приложение , рис. .S2). Что касается таксономического состава на уровне типа или класса, три фракции размером более 3,0 мкм в целом были более похожи друг на друга, чем фракции самого мелкого размера ( SI Приложение , рис. S3). Распределение значений индекса ниши ассоциации частиц (PAN-Index), используемых для определения предпочтений OTU для определенных фракций размера, показало два режима около значений 1,5 и 3,5 ( SI Приложение , рис. S4). Поэтому мы дифференцировали ОТЕ, обогащенные фракциями небольшого размера (PAN-Index <2.7) из обогащенных крупными фракциями (PAN-индекс ≥ 2.7). Мы обнаружили, что предпочтение того или иного образа жизни, по-видимому, филогенетически сохраняется на уровне порядка (но в некоторых случаях не на уровне класса или типа). В то время как некоторые отряды, такие как SAR11, SAR324 или Acidimicrobiales, отдавали предпочтение фракциям небольшого размера, другие отряды, такие как Rhizobiales, Alteromonadales или Planctomycetales, предпочтительно были обогащены фракциями большого размера (PAN-индексы ≥ 2.7; SI Приложение , рис.S5).

Вертикальная связь между океаническими прокариотическими сообществами.

Чтобы определить вертикальную связь между прокариотическими сообществами, мы исследовали, могут ли OTU, присутствующие на одной глубине, быть обнаружены на других глубинах. Для этого все OTU были разделены на четыре группы по глубине: поверхностные (SFC), глубинные максимумы хлорофилла (DCM), мезопелагические (MESO) и батипелагические (BATHY), определяемые глубиной, на которой они были впервые обнаружены, с учетом направленности. от поверхности до батипелагических вод с учетом всех станций вместе.Например, если OTU был обнаружен в любом из образцов поверхности, он был отнесен к категории SFC, но если OTU был впервые обнаружен в мезопелагических водах, но не на предыдущих глубинах (на поверхности и DCM), он был отнесен к категории MESO, и скоро. Для этой категоризации использовалась нерассмотренная таблица OTU, чтобы мы могли обнаружить наибольшее количество OTU на выборку. Этот анализ показал, что даже несмотря на то, что новые OTU непрерывно появлялись при перемещении с одной глубины на другую (рис. 2), в сообществах со всех глубин и всех размерных фракций в значительной степени преобладали OTU, присутствующие в поверхностных водах (SFC OTU).Когда эта категоризация ОТЕ проводилась с учетом каждой станции отдельно, мы наблюдали аналогичную картину, но на некоторых станциях был больший вклад ОТЕ, не присутствующих в поверхностных водах в глубоких слоях, особенно в свободноживущей фракции ( SI Приложение , рис. S6). Это указывает на то, что некоторые из DCM, MESO или BATHY OTU на некоторых станциях не присутствовали на поверхности этих конкретных станций, но присутствовали в поверхностных водах на других участках. В любом случае в батипелагических сообществах всех станций численно преобладали поверхностные последовательности, что указывает на высокую вертикальную взаимосвязь микробных сообществ открытого океана.Это означает, что изменения сообществ по глубине (рис. 1 B ) в значительной степени связаны с сдвигами в относительной численности таксонов, присутствующих в водной толще (например, редкие поверхностные таксоны, которые становятся многочисленными в более глубоких слоях).

Вклад ОТЕ, классифицированных как поверхностные (SFC), глубокие максимумы хлорофилла (DCM), мезопелагические (MESO) и батипелагические (BATHY), в каждой фракции глубины и размера, выраженной как ( A ) процент OTU и ( B ) процент последовательностей.Категория каждой OTU была определена как глубина, на которой они были впервые обнаружены, с учетом направления от поверхности к батипелагическим водам и рассмотрения всех станций вместе (подробности см. В Материалы и методы ).

Вертикальная дифференциация между сообществами данной размерной фракции постепенно изменялась от свободноживущих прокариотических сообществ к сообществам в самых крупных частицах (рис. 3), а различия между фракциями малого и большого размера были статистически значимыми (критерий Вилкоксона, P значение <0.001). Мы обнаружили наивысшее бета-разнообразие и оборот OTU среди глубин во фракции 0,2–0,8 мкм (рис. 3 A и B ), что указывает на более высокую замену OTU внутри свободноживущих сообществ на глубине по сравнению с сообществами, прикрепленными к самые большие частицы. И наоборот, сообщества из фракции самого большого размера показали более высокую степень вложенности (рис.3 C ), а OTU присутствовали на большей глубине (рис.3 D ) по сравнению с сообществами фракций меньшего размера, что позволяет предположить, что сообщества прикреплены к более крупным частицам. они более связаны в толще воды, чем свободноживущие или прикрепленные к мелким частицам.Затем мы разделили SFC OTU (т. Е. OTU, обнаруженные на любой из наземных станций; см. Выше) на те, которые обогащены фракциями небольшого размера (индекс PAN <2.7) и те, которые обогащены фракциями большого размера (индекс PAN ≥ 2.7) и сравнили их распределение вдоль водной толщи на мелкие (и взвешенные, т.е. <3,0 мкм) и большие (и опускающиеся, т.е. ≥3,0 мкм) фракции (рис. 4). Мы обнаружили, что поверхностные OTU, присутствующие в фракциях с наименьшим размером поверхности (SFC OTU с PAN-Index <2.7), объясняют уменьшение доли сообществ в сторону более глубоких вод в мелких фракциях взвешенных частиц (рис.4 A ) и составляли около 25% от численности в самых крупных фракциях вдоль водной толщи (рис. 4 B ). Напротив, большинство батипелагических сообществ состояло из ОТЕ, присутствующих на поверхности в ассоциации с крупными частицами (SFC OTU с PAN-индексом ≥ 2.7), которые составляли около 80% батипелагических толщ в самых крупных фракциях (Рис. 4 B ) и более 50% батипелагических толщ во взвешенных фракциях (рис. 4 A ). Это говорит о том, что глубоководные сообщества в значительной степени населены поверхностными микробами, прибывающими через самые крупные частицы, и что это расселение в основном влияет на сообщества, прикрепленные к батипелагическим частицам (рис.4 B ), но и глубоководные свободноживущие сообщества (рис. 4 A ). Колонизация свободно живущих батипелагических сообществ тонущими частицами также подтверждается наблюдением, что свободноживущие сообщества батипелагических более похожи на присоединенные сообщества батипелагических, чем любые другие сообщества (рис. 1). Напротив, свободноживущие сообщества на поверхности вносят гораздо меньший вклад в батипелагическое разнообразие, вероятно, из-за их более ограниченного вертикального расселения.

Вертикальное изменение бета-разнообразия ( A ) (т.е. дифференциация сообществ), ( B ) пространственный оборот OTU (т.е. замена видов), ( C ) вложенность (потеря видов) и ( D ) ширина ниши (т. Е. Специализация среды обитания OTU на основе количества глубин, на которой была обнаружена OTU) для каждой фракции размера. Значения были рассчитаны для глубин, для каждой фракции размера и отдельно для каждой станции. Коробчатые диаграммы суммируют данные с восьми станций.Бета-разнесение содержало значения от 1 до 4, где 1 указывает, что все OTU с четырех глубин одинаковы, а 4 указывает, что OTU с четырех глубин полностью различны. Бета-разнообразие можно разделить на две составляющие: текучесть и вложенность. Оборот указывает на замену одних OTU другими от глубины к глубине, а вложенность указывает подмножество OTU от одной глубины к другой. И текучесть, и вложенность имели значения от 0 до 1, что указывало на уровень вклада в бета-разнообразие.Ширина ниши рассчитывалась для каждой OTU, указывая количество глубин, на которых была обнаружена OTU. Значения варьировались от 1 до 4, где 4 указывает, что данная OTU присутствует на четырех глубинах (т. Е. Более высокие значения прямоугольной диаграммы указывают, что OTU заданной доли размера присутствовали на большей глубине). См. Материалы и методы для получения более подробной информации.

Вертикальная вариация вклада (в процентах от последовательностей) поверхностных ОТЕ, обогащенных мелкими фракциями (PAN-Index <2.7) (светло-серый) и поверхностных ОТЕ, обогащенных крупными фракциями (PAN-индекс ≥ 2.7) (темно-серый), до сообществ, присутствующих во фракциях ( A ) фракциях <3,0 мкм и ( B ) фракциях ≥3,0 мкм и при каждая глубина. Коробчатые диаграммы суммируют данные с восьми станций. См. Материалы и методы для получения дополнительной информации.

Перенос биогеографических закономерностей с поверхности в глубокое море.

Учитывая более высокий вертикальный перенос микробов, связанных с более крупными частицами, можно ожидать, что пространственные различия (т.е.е., различия между станциями) между сообществами из самых крупных частиц поддерживаются вертикально, тогда как ожидается, что взвешенные сообщества будут более изолированными по вертикали, и, таким образом, их поверхностные биогеографические структуры не будут перенесены на глубину. Мы проверили этот вывод, сравнив для каждой размерной фракции пространственные различия между поверхностными сообществами и мезопелагическими или батипелагическими сообществами, используя тесты Mantel (Таблица 1). Мы обнаружили, что различия между взвешенными сообществами с поверхности и мезопелагическими или батипелагическими водами существенно не коррелировали.Напротив, различия между сообществами, прикрепленными к частицам с поверхности и глубоководными водами, показали высокую значительную корреляцию (Таблица 1), предполагая, что различия в составе между станциями глубоководных сообществ, связанных с частицами, были вызваны, по крайней мере, частично биогеографическими данными. паттерны поверхностных ассоциаций, прикрепленных частицами.

Сравнение структуры сообществ между глубинами

Представленные результаты подтверждают гипотезу о том, что биогеография поверхностных прокариот, прикрепленных к частицам, переносится в более глубокие воды через опускание частиц, но тот факт, что сообщества из фотической и афотической сфер были очень значительными. разные по таксономическому составу ( SI Приложение , рис.S3) предполагает, что это вертикальное расселение прикрепленных к частицам микробов должно сопровождаться большими изменениями их численности во время погружения. Например, рост таксонов, которые были редкими (и, возможно, бездействующими) в поверхностных водах, но могут процветать на более глубоких глубинах, может объяснить такие изменения состава. На каждой станции мы определили OTU, которые потенциально могут расти во время опускания частиц, путем выбора поверхностных OTU, преобладающих в фракциях большего размера (SFC OTU с индексом PAN ≥ 2.7), относительная численность (преобладание) которых увеличивалась по направлению к более глубоким водам, названные здесь как « seed »ОТЕ (см. подробности в « Материалы и методы »).Мы идентифицировали в общей сложности 90 семенных OTU, которые составляли ~ 6% последовательностей на поверхности, и показали явное увеличение относительной численности к более глубоким водам до 55% (в среднем ~ 35%) от общей численности в батипелагических частицах, прикрепленных к ним. сообщества (рис. 5). Пул таксонов, ведущих себя как семена, различался между станциями, и на каждой станции были обнаружены разные доминирующие группы семян (например, Oceanospirillales доминируют на станции 20, Sphingobacteriales на станции 77 и Corynebacteriales на станции 94) (рис.5). Более того, когда мы исследовали структуру сообщества только этих исходных OTU, мы обнаружили, что они сгруппированы в соответствии с восемью станциями ( SI Приложение , рис. S7). Этот географический признак был менее ясен для фракций наименьшего размера (более мелкие символы) в некоторых случаях, но все же он указывает на высокую значимость процессов колонизации поверхностными частицами для определения структуры сообществ из более глубоких слоев.

Динамика ОТЕ семян на каждой станции и по глубине.Seed OTUs — это поверхностные OTU, обогащенные фракциями большего размера, относительная численность которых увеличивается с глубиной. Данные представляют вклад OTU, отнесенных к категории семян, в общие последовательности сообществ, связанных с фракциями наибольшего размера (≥3,0 мкм; подробности см. В Results ). Круговые диаграммы показывают таксономический состав на уровне порядка (в процентах последовательностей) исходных OTU на каждой станции. Обратите внимание на разные масштабы на графиках.

Обсуждение

Наши результаты подтверждают гипотезу о сильной опосредованной частицами прокариотической связи между поверхностью и глубинами океана, гипотезу, предложенную ранее (например,г., исх. 42 и 43) и протестированы здесь. Большинство доминирующих прокариот из глубоководных районов океана также можно обнаружить в поверхностных водах, и эта вертикальная связность выше в сообществах, связанных с фракциями большего размера (то есть с более крупными частицами), вероятно, из-за их более высокой скорости погружения. Наши результаты показывают, что опускание частиц представляет собой вектор распространения жизнеспособного микробного разнообразия из поверхностных вод в батипелагическую зону, что в конечном итоге определяет биогеографию глубоководных прокариот.Они также предполагают, что тонущие частицы действительно могут быть подходящим источником жизнеспособных таксонов для глубоководных океанов, в соответствии с предыдущими исследованиями, предполагающими существование океанического резервуара спящего разнообразия (44–46).

Хотя вертикальная дифференциация сообществ от фотических к афотическим царствам хорошо задокументирована (например, ссылки 47–49), мы показываем здесь, что это различие зависит от размера частиц и является наибольшим среди свободноживущих сообществ и прокариотических сообществ, связанных с самые мелкие фракции (рис.1 и SI Приложение , рис. S3 и таблица S1). Наши результаты также согласуются с предыдущими исследованиями, показывающими, что прокариотические сообщества сильно различаются между свободноживущими (взвешенными) и прикрепленными фракциями в эпипелагических (29, 43, 50), а также в батипелагических (10, 51, 52) водах, подтверждая наличие ниш. на частицах отличны от растворенной фазы. Другие показали, что состав более крупных частиц отличается от состава более мелких частиц (а также от растворенной фазы), причем более крупные частицы являются более молодыми и более лабильными, а более мелкие частицы являются более старыми и более стойкими (31, 32).

Вывод о том, что во всех сообществах, включая те, что населяют батипелагический слой, численно преобладали ОТЕ, присутствующие в поверхностных водах, подтверждает сильную вертикальную связь между поверхностными и батипелагическими сообществами на местном ( SI Приложение , рис. S6) и глобальном масштабе. (Рис. 2) шкалы. Учитывая изменчивость по глубине в структуре сообществ (рис. 1 и SI Приложение , рис. S3), вертикальные изменения в сообществах прокариот, вероятно, вызваны изменениями в относительной численности таксонов, присутствующих на нескольких глубинах во время погружения, я.е., редкие поверхностные таксоны, которые становятся многочисленными в более глубоких водах. Лишь несколько недавних исследований оценили вертикальную связность морских прокариотических сообществ вдоль водной толщи, указав, что адвекция и конвекция водных масс могут формировать структуру поверхностных и глубинных микробных сообществ, способствуя их переносу и колонизации новой среды обитания (20–22 ). Однако эти исследования были сосредоточены только на свободноживущих сообществах и процессах вертикального переноса водных масс как движущем механизме.Здесь мы приводим доказательства того, что вывоз тонущих частиц представляет собой важный путь распространения разнообразия от поверхностных до батипелагических вод. Хотя этот процесс можно рассматривать как однонаправленный от поверхности к глубоководным водам, что подтверждается свидетельствами быстрого опускания частиц с поверхности в глубину океана вдоль станций, отобранных экспедицией Маласпины (53), также возможно, что события апвеллинга глубинных вод — водные массы переносят жизнеспособных глубоководных прокариот обратно в поверхностные воды.Эта возможность должна быть проверена в будущих исследованиях в зонах апвеллинга.

Гипотеза о том, что вертикальная прокариотическая связность обусловлена ​​рассеянием таксонов от поверхности к более глубоким водам под действием тонущих частиц, дополнительно подтверждается наблюдением, что связность по всей вертикальной колонке выше для сообществ, связанных с самыми крупными частицами, чем для прикрепленных к меньшим, как и ожидалось из-за более быстрого опускания более крупных частиц (например, скорость опускания <1 м⋅д ^-1 для мелких частиц и> 1000 м⋅д ^-1 для крупных агрегатов, рассмотрено в исх.3). Например, состав сообщества фракций меньшего размера был более изменчивым между глубинами (т. Е. Более высокое бета-разнообразие), чем состав сообщества фракций самого большого размера (Рис. 3 A и SI Приложение , Таблица S2). Кроме того, наибольшее замещение (оборот) OTU по глубине было обнаружено между сообществами из мельчайших частиц, а OTU из сообществ, связанных с самыми крупными частицами, были наиболее распространенными по глубине (Рис. 3 C ). В целом это указывает на более интенсивное вертикальное рассредоточение таксонов между сообществами из фракций наибольшего размера, тогда как сообщества прокариот из фракций наименьшего размера имеют более ограниченное распределение по глубине, т.е.е., более изолированы по вертикали из-за их более ограниченной возможности подключения.

Кроме того, мы наблюдали, что ОТЕ с предпочтением крупных частиц в поверхностных водах также доминируют в мезопелагических и батипелагических сообществах (рис. 4). Тот факт, что глубинные сообщества в фракциях небольшого размера также в значительной степени состояли из прикрепленных к поверхности прокариот (рис. батипелагический слой по сравнению с любыми другими (рис.1), предполагает, что большие частицы действительно являются векторами, транспортирующими жизнеспособных прокариот с поверхности в батипелагическую среду, некоторые из которых могут процветать в свободноживущей части батипелагической области. Таким образом, перенос прокариот из поверхностных вод в глубокие воды происходит в основном с помощью крупных частиц, которые действуют как источник потенциальных иммигрантов (или инокулята) для взвешенного сообщества, живущего в глубоких океанских глубинах. Эти результаты согласуются с предыдущим исследованием, показывающим, что определенные таксоны могут менять свои предпочтения от крупных частиц к мелким по глубине (51), вероятно, в зависимости от условий окружающей среды.

Частицы имеют весьма неоднородный органический и неорганический состав, который изменяется во время погружения, но в основном определяется условиями окружающей среды поверхностных вод, в которых они образовались (25, 34, 35). Такой состав частиц определяет колонизацию и структуру исходного микробного сообщества (см. Ссылку 54). Из этого следует, что пул таксонов с дисперсными частицами, который тонет и имеет потенциал к процветанию при попадании в более глубокие слои, будет зависеть от местных условий и происхождения частиц в поверхностных водах и должен различаться на разных станциях.Мы проверили эту гипотезу, идентифицировав пул прокариот, прикрепленных к поверхностным частицам, которые увеличили свою относительную численность по направлению к более глубоким водам, которые действуют как семенные OTU. Эти OTU принадлежали к разным таксономическим группам на разных исследованных станциях, что, вероятно, указывает на влияние первоначальных колонизаторов поверхностных частиц на локальное определение сообществ глубоководных микробов. Это означает, что тонущие частицы переносят различные сообщества, но некоторые из этих таксонов [вероятно, спящие или медленно растущие (55)] могут расти и доминировать в глубоководных сообществах, когда окружающие условия окружающей среды или природа частиц меняются, как они есть. переносится в более глубокие воды.Кроме того, другие таксоны могут уменьшать свою относительную численность с глубиной, поскольку они находят неблагоприятные условия при перемещении с поверхности в глубину океана (51). Подобный процесс также наблюдался в других экосистемах, таких как континуум пресной воды от реки к озеру, где было показано, что перенос и рост редких бактерий из наземных источников в значительной степени определяет структуру принимающих водных сообществ (39). Эти результаты совпадают в том, что подчеркивают необходимость учета потенциальных источников распространения для понимания наблюдаемых биогеографических закономерностей.Сосредоточившись на свободноживущих прокариотах, Wilkins et al. (20) предположили, что адвекция масс морской воды может формировать структуру микробного сообщества, увеличивая возможности для колонизации. Однако, учитывая ограниченный глубинный вертикальный перенос воды в открытом океане, тонущие частицы, вероятно, будут играть ключевую роль в определении и формировании вертикальной взаимосвязанности океанических микробных сообществ на большей части мирового океана, обеспечивая непрерывное распространение жизнеспособных организмов в мезопелагическом океане. и батипелагические царства.

Несмотря на общее восприятие однородного темного океана, геномные подходы выявили огромную и динамичную генетическую изменчивость глубоководных микробных сообществ (см. Ссылку 3). Действительно, недавний глобальный обзор прокариотических сообществ в батипелагической области показал, что они различаются между океаническими бассейнами и что этот биогеографический сигнал был сильнее для членов, прикрепленных к частицам (фракция размером 0,8–20 мкм), чем для их свободноживущих собратьев (0,2 –0,8 мкм фракция) (36).Это согласуется с нашим наблюдением, что на всех глубинах сообщества из самых крупных частиц показали гораздо более четкие различия между станциями, чем свободноживущие сообщества ( SI Приложение , Таблица S2). Однако мы заметили, что различия в составе между наземными станциями сообществ, связанных с частицами, коррелировали с различиями в составе между глубоководными станциями, и что сила этой корреляции возрастала с увеличением размера частиц, тогда как для поверхности и поверхности такая закономерность не наблюдалась. .свободноживущие глубинные сообщества (таблица 1). В целом это указывает на то, что биогеография глубоководных сообществ отражает биогеографию вышележащих поверхностных сообществ как следствие опосредованного частицами распространения и, таким образом, частично определяется биогеографией прикрепленного прокариотического сообщества, происходящего на поверхности. Салазар и др. (36) предположили, что подводные горы, разделяющие океан на бассейны, могут действовать как экологические барьеры для прокариотических сообществ, способствуя их дифференциации.Однако этим объясняется небольшая часть различий в составе сообщества. Наши результаты также предполагают, что таксономические различия пула таксонов, прибывающих через тонущие частицы, также могут быть основным механизмом, объясняющим наблюдаемые биогеографические структуры глубоководных прокариот.

В нашем дизайне исследования, основанном на сравнении структуры прокариотических сообществ вдоль вертикальных профилей, мы описали изменчивость состава сообществ вдоль водной толщи в вертикальном градиенте, определяемом четырьмя глубинами, отобранными на каждой станции.Нам известно, что описанные процессы не связаны напрямую по вертикали, потому что горизонтальные скорости переноса могут быть больше, чем скорости погружения. Следовательно, точки отбора проб на каждой глубине должны рассматриваться как репрезентативные образцы более широкой области (т.е. они не должны интерпретироваться как точки, расположенные непосредственно друг над другом, а скорее как вертикальные профили с образцами, представляющими большую площадь). Тем не менее, аналогичные закономерности наблюдались при анализе каждой станции в отдельности ( SI Приложение , рис.S6) и все станции вместе (рис. 2). Кроме того, наблюдаемое сходство в биогеографических паттернах между поверхностными и глубоко прикрепленными сообществами (таблица 1), а также характерная для станции подпись в пуле таксонов, способных расти на тонущих частицах ( SI Приложение , рис. S7). ), по всей видимости, подтверждает, что действительно существует вертикальное соединение в пределах области, представленной каждой станцией выборки.

Таким образом, мы показываем, что прокариотический микробиом глобального океана демонстрирует сильную вертикальную связь через всю толщу воды.Эта связь происходит через опускание частиц, что подчеркивает роль частиц как микробных переносчиков, которые вносят жизнеспособные поверхностные таксоны в глубокие океаны. Кроме того, наши результаты показывают, что во всех местных сообществах преобладают ОТЕ, которые уже присутствуют в поверхностных водах; что есть ОТЕ с поверхности, которые процветают на глубине; и что на биогеографию батипелагической области до некоторой степени влияют события колонизации частицами, происходящие в поверхностных водах. Поэтому вклад как частиц, так и прикрепленных к ним сообществ в батипелагическое царство кажется решающим.К существующим свидетельствам того, что тонущие частицы являются важным источником углерода и питательных веществ для развития гетеротрофной жизни в глубоких океанских глубинах (3, 4), наши результаты добавляют, что сообщества, прикрепленные к частицам, являются источником жизнеспособного разнообразия для более глубоких слоев океана. Учитывая, что батипелагическое царство состоит в основном из медленно тонущих или плавучих частиц (4), которые являются богатыми ресурсами средами обитания микробов (56), и что глубоководные прокариоты более приспособлены к прикрепленному образу жизни, чем поверхностные (57⇓⇓ –60), глубоководная микробная активность и жизнь должны быть сконцентрированы на частицах (3, 6, 57).Следовательно, это управляемое частицами распространение микробов, вероятно, представляет собой фундаментальный механизм, влияющий на структуру, сборку и функционирование глубоководных микробных сообществ по всему Мировому океану.

В заключение мы описываем управляемую частицами вертикальную дисперсию прокариот с поверхности в глубину океана, и наши результаты предполагают множество дополнительных вопросов, которые могут быть исследованы в будущем. Возвращаются ли микробы, которые тонут, когда-нибудь на поверхность океана, или существует механизм распространения, который возвращает их на поверхность? Если переносимые микробы напрямую зависят от процессов, происходящих на поверхности, как изменчивость состава частиц и скорости погружения влияет на сообщества в глубинах океана? Является ли расселение организмов, прибывающих с поверхности, главным процессом, определяющим биогеографию глубоководных океанов? Здесь мы раскрываем важность вертикальной дисперсии, управляемой частицами, но актуальность других механизмов дисперсии в структурировании микробных сообществ океана в глобальном масштабе еще предстоит оценить, механизмы, которые могли бы объяснить, например.g., как организмы, считающиеся эндемиками жерловых систем, могут колонизировать географически и потенциально изолированные отдаленные гидротермальные среды обитания (45). Постулируемое существование глобального банка семян в океане (44) требует выявления различных прокариотических механизмов, ответственных за распространение. Наши результаты свидетельствуют об одном таком механизме, происходящем в глобальном масштабе.

Материалы и методы

Район исследования и отбор проб.

Всего мы отобрали восемь станций из тех, что были взяты во время экспедиции Маласпина 2010 (61) в период с декабря 2010 г. по июль 2011 г.Отобранные станции были распределены в глобальном тропическом и субтропическом океане (между 30 ° северной широты и 40 ° южной широты): три в Атлантическом океане, две в Индийском океане и три в Тихом океане. На каждой станции отбирались пробы четырех глубин, соответствующих поверхности (SFC, 3 м), глубинному максимуму хлорофилла (DCM, 48–150 м), мезопелагическим (MESO, 250–670 м) и батипелагическим водам (BATHY, 3,105–4,000 м). Образцы поверхностной воды отбирались с помощью бутылки Нискина, а пробы воды с других глубин отбирались с помощью розетки бутылок Нискина, прикрепленных к профилометру проводимость-температура-глубина (CTD).Вертикальные профили солености, потенциальной температуры и растворенного кислорода регистрировались непрерывно с помощью датчиков CTD, установленных в розеточном пробоотборнике. Питательные вещества (нитраты, фосфаты и диоксид кремния) определяли с использованием стандартных процедур, как описано в Catalá et al. (62). Численность и размер бактерий определяли с помощью проточной цитометрии, а продукцию гетеротрофных бактерий оценивали с использованием метода включения ³ H-лейцина (63), как подробно описано в ссылке. 64.

Прокариотическая биомасса из фракций разного размера была собрана путем предварительной фильтрации воды через сетку с размером ячеек 200 мкм и последовательного фильтрования 10 л через 20-, 5.Фильтры с размером пор 0, 3,0, 0,8 и 0,2 мкм, все поликарбонатные фильтры 47 мм (фильтр с размером пор 20 мкм от GE Water and Process Technologies и остальные фильтры от Millipore) с использованием перистальтический насос, позволяющий получать фракции пяти различных размеров (0,2–0,8, 0,8–3,0, 3,0–5,0, 5,0–20 и 20–200 мкм). Засорение фильтра или смещение частиц может повлиять на таксономический состав, наблюдаемый в каждой крупной фракции (65), но мы попытались минимизировать эти проблемы, фильтруя с очень низкой скоростью и давлением и часто меняя фильтры.Фильтры быстро замораживали в жидкости N ₂ и хранили при -80 ° C до экстракции ДНК. Мы предполагаем, что фракция размером 0,2–0,8 мкм будет содержать в основном свободноживущие прокариотические сообщества, которые остаются взвешенными в толще воды, а остальные фракции размера будут включать прокариоты, связанные с различными типами частиц (например, гели, органические и неорганические частицы). частицы, живые или неживые организмы) различных размеров, которые будут влиять на скорость их опускания. Определим 0.2–0,8 и 0,8–3,0 мкм как фракции малого размера (или мелкие частицы, взвешенные частицы), тогда как 3,0–5,0, 5,0–20 и 20–200 мкм определяются как фракции большого размера (или крупные частицы, тонущие частицы).

Выделение ДНК, секвенирование и обработка последовательностей.

ДНК экстрагировали фенол-хлороформным протоколом (как описано в ссылке 66). Гипервариабельный участок V4 – V5 гена 16S рРНК амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами 515F-926R (67) и секвенировали на платформе Illumina MiSeq с использованием метода парных концов 2 × 250 п.н. в Центре научно-исследовательской и испытательной лаборатории (rtlgenomics.com /). Вычислительные анализы проводились на платформе биоинформатики Marbits в Institut de Ciències del Mar. Ампликоны обрабатывались по протоколу (подробно описанному в ссылке 68), основанному на Uparse (69). Вкратце, чтения были собраны с помощью PEAR (Paired-End reAd mergeR) (70), и были отобраны считывания с> 100 нуклеотидами. Проверка качества, дерепликация, кластеризация OTU (99%) и фильтрация химер на основе ссылок (с использованием базы данных Silva v.119) обрабатывались с помощью Usearch (71). Таксономическое назначение OTU было произведено с помощью BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) поиска репрезентативных последовательностей в базе данных Silva v.123. Непрокариотические ОТЕ (эукариоты, хлоропласты и митохондрии), а также одиночные клетки были удалены. Чтобы позволить сравнения между выборками, таблица OTU была случайным образом разбита на подвыборку по количеству считываний, присутствующих в выборке с наименьшим количеством считываний (которое составляло n = 5,390), и всего было получено 13 567 OTU.

Анализ данных.

Статистический анализ и графики были выполнены в R (www.r-project.org) с использованием vegan (72), simba (73), spaa (74), betapart (75) и BiodiversityR (76) пакетов.Богатство OTU каждой размерной фракции и на каждой глубине рассчитывалось с использованием таблицы разреженных OTU, а метрика Брея – Кертиса использовалась в качестве оценки различия сообществ. Чтобы проверить, были ли сообщества структурированы стохастически или нет, был рассчитан индекс RC _Bray . Индекс состоит из метрики Раупа – Крика (77) с использованием различий Брея – Кертиса (41). Всего было выполнено 1000 рандомизаций для OTU с> 100 чтениями во всем наборе данных. Сообщества были сгруппированы с использованием неметрического многомерного анализа (nMDS) на основе расстояний Брея-Кертиса.Статистические различия между такими категориями, как размерная фракция, пикет и глубина, были исследованы с помощью перестановочного многомерного анализа дисперсии (PERMANOVA) (функция Адониса, пакет R vegan ).

Чтобы выяснить взаимосвязь между сообществами по всей водной толще определенной фракции, был рассчитан набор параметров для каждой станции отдельно: вертикальное бета-разнообразие (т.е. дифференциация сообществ) было рассчитано с использованием функции trudi из пакета R Симба .Вертикальный оборот OTU (т. Е. Несходство из-за смены видов) и вложенность (т. Е. Несходство из-за потери видов) оценивались с помощью функции beta.multi в пакете R betapart и основывались на индексе Соренсена. Ширина вертикальной ниши каждой OTU была рассчитана с использованием функции niche.width в пакете R spaa и с применением индекса Левинса (78). Ширина ниши определялась как количество различных глубин, на которых появлялись OTU (т.е., OTU со значениями ширины ниши, равными 4, присутствовали на четырех глубинах, тогда как OTU со значениями ширины ниши, равными 1, присутствовали только на одной глубине), и среднее значение всех значений ширины ниши для OTU каждой станции было рассчитано. Чтобы проверить, были ли различия между фракциями малого и большого размера статистически значимыми по параметрам бета-разнообразия, оборачиваемости, вложенности и ширины ниши, был проведен ранжированный критерий Уилкоксона, сравнивающий фракции размером 0,2–0,8 мкм и 20–200 мкм.Корреляции между сообществами из разных фракций и глубин рассчитывались с помощью теста Мантеля (на основе расстояний Брея – Кертиса).

Чтобы различать OTU, доминирующие (т.е. обогащенные, с предпочтением) фракции меньшего и большего размера, мы определили PAN-индекс. PAN-индекс указывает, в какой размерной фракции OTU более многочисленна (и, следовательно, более доминирует над другими OTU), и был рассчитан с использованием взвешенного по численности среднего значения каждой OTU среди пяти размерных фракций.Этот PAN-индекс определяет предпочтение доли размера каждой OTU в континууме размеров (то есть, в какой доле размера OTU является более доминирующей) и является модификацией индекса PAN, представленного в Salazar et al. (52), где учитывались только две размерные фракции (свободноживущие и прикрепленные). Значения индекса PAN варьировались от 1 до 5, и каждое число отражает предпочтение размера данной OTU следующим образом: 1, предпочтение фракции размера 0,2–0,8 мкм; 2, предпочтение от 0,8 до 3,0 мкм; 3, предпочтение 3.0–5,0 мкм; 4, предпочтение от 5,0 до 20 мкм; и 5 — предпочтение фракции размером 20–200 мкм. Значения PAN-индекса представляли бимодальное распределение ( SI Приложение , рис. S4), и мы, следовательно, разделили их на две группы: OTU с PAN-Index ≥ 2.7 (т. Е. Те, которые предпочитают большие частицы) и OTU с PAN. -Index <2.7 (т.е. те, которые предпочитают мелкие частицы). Чтобы идентифицировать пул таксонов, потенциально растущих в тонущих частицах, мы сначала выбрали поверхностные OTU с PAN-Index ≥ 2.7 те, которые демонстрируют наибольшие сдвиги в относительной численности путем расчета евклидова расстояния их относительной численности между всеми парами образцов и выбора OTU со средним расстоянием> 10, следуя Руис-Гонсалесу и др. (39). Затем мы определили те, относительная численность (преобладание) которых увеличивалась к более глубоким слоям (т. Е. Показывающие более высокие средние относительные содержания в мезопелагических и / или батипелагических водах, чем в поверхностных и / или DCM). Это было сделано для каждой станции, и эти OTU были названы исходными OTU, потому что они могут представлять таксоны, засевающие более глубокие сообщества.

Благодарности

Мы благодарим всех ученых и команду за их поддержку во время сбора проб в рейсе Маласпина 2010, и особенно Э. Боррулла, К. Диес-Вивеса, Э. Лара, Д. Ваке, Г. Салазара и Ф. Корнехо-Кастильо для отбора проб ДНК. К. Антекера любезно предоставил лабораторную помощь при выделении ДНК. Мы также благодарны Г. Салазару за его помощь в адаптации индекса PAN к фракционированию по нескольким размерам. Мы благодарим платформу биоинформатики Marbits Института Китая дель Мар в Барселоне и особенно Пабло Санчеса за компьютерную поддержку.М.М. была поддержана Высшим советом по расследованию сентификас-хунта пара ла Амплиасион де Estudios Grant (CSIC-JAE-Predoc Grant) и Министерством труда, занятости и социального обеспечения. R.L. был поддержан стипендией Рамона и Кахала (RYC-2013-12554, Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), Испания) и C.R.-G. был поддержан стипендией Хуана де ла Сьервы (IJCI-2015-23505). Это вклад в экспедицию Malaspina 2010, финансируемую Министерством экономики и конкурентоспособности Испании в рамках программы Consolider-Ingenio (Ссылка CSD2008-00077).

• Copyright © 2018 Автор (ы). Опубликовано PNAS.

Полуавтоматический отбор криоЭМ частиц в РЕЛИОН-1.3

2.1. Сбор частиц

Предложенный алгоритм отбора частиц на основе шаблона использует аддитивную модель с белым гауссовским шумом в реальном пространстве. Микрофотография X , которая содержит N отдельных частиц i в координатах t → i на микрофотографии, описывается следующим образом (см. Также A):

X (r →) = μ (r →) + σ (r →) ∗ N (r →) + ∑i = 1NAkiϕi (r → -t → i),

(1)

где:

• • X (r →) — это микрофотография, т.е.е. двумерное изображение, которое было записано в электронный микроскоп, и r описывает двухмерное положение на этом изображении.
• • N (r →) — изображение независимого (или белого) гауссовского шума с нулевым средним и единичным стандартным отклонением.
• • μ (r →) и σ (r →) — это позиционно-зависимые аддитивные и мультипликативные коэффициенты нормализации , которые приводят зарегистрированные уровни шума на микрофотографии к нулю и среднему значению стандартного отклонения. Вариации μ и σ с положением обычно описывают экспериментальные изменения толщины льда, дозы электронов, и т. Д. .
• • Akiϕi — один из известных K , двухмерный шаблон изображений A _k с внутренними позициями q →. Обычно изображения шаблона намного меньше, чем микрофотография (в суммировании выше, изображение шаблона имеет нулевое значение за пределами определенного размера коробки). Следовательно, для любого заданного r → и шаблона A _{k i} в позиции t → i внутренняя позиция будет q → = r → -t → i. Различные изображения шаблона K могут описывать проекции одной и той же молекулы в разных направлениях или они могут описывать проекции разных молекул; k _i описывает, какое из шаблонных изображений соответствует i -й частице; и ϕ _i описывает относительное вращение в плоскости между частицей и этим шаблоном изображения.

Схематическое изображение модели данных. (A) Представление микрофотографии с векторами координат r = ( r _x , r _y ) внутри микрофотографии и векторами координат q = ( q _x , q _y ) внутри каждого изображения частицы. Векторы t _i = ( t _x , t _y ) поместите частицу i th внутри микрофотографии с неизвестным вращением в плоскости ϕ _i относительно общей системы координат.Вставка (B), маска M _o , которая используется для нормализации изображений частиц: среднее и стандартное отклонение пикселей фона вычисляются в белой области этой маски. Вставка (C), маска M _i , которая используется для алгоритма сортировки частиц: вся статистика по разностным изображениям между каждой частицей и соответствующим ей шаблоном вычисляется в белой области этой маски.

Учитывая X (r →) и K изображений шаблона A _k , задача состоит в том, чтобы идентифицировать все N комбинаций t → i, ϕi и k _i .Основываясь на положительном опыте применения подходов максимальной вероятности, например см. (Scheres et al., 2007; Scheres, 2012a), выбор был сделан для реализации метрики подобия, основанной на вероятности, для этой задачи. Предположение о гауссовском шуме в формуле. (1) естественным образом приводит к гауссовской мере подобия. В отличие от коэффициента взаимной корреляции, который используется, например, в основанной на шаблоне программе выбора findEM (Roseman, 2003, 2004), квадрат разности внутри гауссовой метрики не инвариантен к умножению или сложению константы.Это означает, что необходимо учитывать различные уровни интенсивности на записанных микрофотографиях, а также необходимо определить коэффициенты нормализации μ (r →) и σ (r →), чтобы привести все частицы к одному и тому же уровню интенсивности.

После извлечения отдельных частиц из микрофотографий, RELION полагается на процедуру нормализации, которая использует круг (с заданным пользователем радиусом R , см. B) для разделения каждого извлеченного изображения частицы в области фона (за пределами круга) и область частицы (внутри того же круга) (Sorzano et al., 2004). Путем вычитания среднего значения пикселей в области фона из всего изображения частицы и последующего деления всего изображения на стандартное отклонение пикселей в области фона, уровни шума с нулевым средним и единичным стандартным отклонением получаются для все частицы, независимо от изменений толщины льда, воздействия или других неконтролируемых экспериментальных факторов.

Та же процедура нормализации используется внутри реализованной процедуры отбора частиц.Используя те же концепции, что и в алгоритме быстрой локальной корреляции внутри findEM (Roseman, 2003, 2004), значения μ (r →) и σ (r →) могут быть эффективно предварительно вычислены для всех r → с использованием быстрых преобразований Фурье (БПФ):

μ (r →) = 1MoFT-1FT (X) FT (Mo) ∗,

(2)

σ (r →) = 1MoFT-1FT (X2) FT (Mo) ∗ — μ2 (r →) ,

(3)

, где FT и FT ^-1 обозначают операции прямого и обратного преобразования Фурье, ∗ обозначает комплексное сопряжение, а M _o представляет собой двоичную маску, как показано на B с M _o белых пикселей.Вторая маска M _i является инверсией M _o и имеет M _i белых пикселей (C).

Учитывая модель данных в формуле. (1) вероятность наблюдения микрофотографии с частицей, соответствующей шаблонному изображению A _k в ориентации ϕ и положении t →, затем определяется умножением гауссиана (со стандартным отклонением, равным единице). ) для каждого пикселя q → внутри маски M _i :

PX | t →, Akϕ∝exp∑q → ∈Mi-12X (q → + t →) -μ (r →) σ (r →) -Akϕ (q →) 2.

(4)

Диапазон значений P (X | t →, Akϕ) зависит от количества пикселей внутри маски M _i и мощности сигнала в Akϕ. Чтобы определить метрику подобия с заранее заданным диапазоном, также вычисляется вероятность наблюдения микрофотографии только с шумом в этой позиции, то есть как для шаблонного изображения с нулевыми значениями O :

P (X | t →, O) ∝exp∑q → ∈Mi-12X (q → + t →) -μ (r →) σ (r →) 2.

(5)

Затем вычисляется отношение P (X | t →, Akϕ) и P (X | t →, O), которое будет обозначаться как Rϕ, k (t →), используя:

Rϕ, k (t →) = P (X | t →, Akϕ) P (X | t →, O) = exp∑q → ∈MiX (q → + t →) Akϕ (q →) σ (r → ) -μ (r →) Akϕ (q →) σ (r →) -12Akϕ (q →) 2.

(6)

Если Rϕ, k (t →)> 1, позиция t → скорее соответствует частице Akϕ, чем растворителю. Ожидаемое значение Rϕ, k (t →) для изображения в соответствии с моделью данных в формуле. (1) рассчитывается как:

E 〈Rk〉 = exp12Mi∑q → ∈MiAk2.

(7)

Следовательно, можно определить метрику подобия, которая принимает значения в значимом диапазоне, выражая дробь:

Sϕ, k (t →) = Rϕ, k (t →) -1E 〈Rk〉 — 1.

(8)

Значение Rϕ, k (t →) -1 выражает, насколько более вероятно, что положение t → соответствует частице Akϕ, чем растворителю.Для идеального сигнала и белого гауссовского шума это значение будет близко к E 〈 R _k 〉 — 1. На практике шаблоны не идеальны, а шум не белый, что приводит к типичным значениям. Rϕ, k (t →) -1 меньше, чем E 〈 R _k 〉 — 1. Следовательно, полезные пороговые значения для поиска пика в Sϕ, k (t →) часто лежат в диапазоне (0,1].

Расчет Sϕ, k (t →) для всех ϕ и k можно эффективно выполнить следующим образом.Вычисление ∑q → ∈MiAkϕ и ∑q → ∈MiAkϕ2 инвариантно для t → и ϕ , и поэтому его необходимо вычислять только один раз для каждого шаблона. Расчет оставшихся неизвестных в уравнении. (6) для всех t →, k и ϕ снова может быть вычислено с использованием кросс-корреляции с ускорением БПФ:

∑q → ∈MiX (q → + t →) Akϕ (q →) = FT-1FT (X ) FT (Akϕ) ∗,

(9)

при условии, что Akϕ (q →) = 0 при q → ∉Mi. Для каждого изображения шаблона A _k и каждого дискретного вращения в плоскости ϕ = 1,…, Φ вычисляется Sϕ, k (t →) для всех t →.Это включает в себя K × Φ оценок уравнения. (9), тогда как уравнения. (2) и (3) необходимо оценивать только один раз для каждой микрофотографии. Пользователь управляет Φ посредством определения угловой частоты дискретизации (обычно 5 градусов). Используемые библиотеки БПФ работают только с квадратными изображениями. Прямоугольные микрофотографии дополняются белым гауссовским шумом для получения изображений в квадрате. Это делается внутренне, поэтому взаимодействие с пользователем не меняется.

Поиск пика сначала выполняется независимо для всех Sϕ, k (t →).Возможные положения частиц выбираются только для локальных максимумов (где четыре соседних пикселя меньше пикового значения) и если пиковое значение выше заданного пользователем порога. Для каждого изображения Sϕ, k (t →) пики обрезаются на основе определяемого пользователем минимального расстояния между частицами. Все пики на этом расстоянии друг от друга сгруппированы вместе. Внутри каждого кластера сохраняется пик с наибольшим значением Sϕ, k (t →), а оставшиеся пики в пределах минимального расстояния между частицами сохраняемого пика отбрасываются.Это делается рекурсивно, так что можно сохранить более одного пика от каждого кластера, но все обрезанные пики будут находиться, по крайней мере, на минимальном расстоянии между частицами друг от друга. Отсеченные пики для всех шаблонов k и все вращения в плоскости ϕ затем объединяются, и объединенный список пиков сокращается с использованием того же алгоритма. Окончательный результат, если список N координат частицы ti →, каждая со значением для соответствующего шаблона k _i и вращением в плоскости ϕ _i .

Хотя явно не написано как таковое в формуле. (1), реализация в RELION-1.3 выполняется таким образом, что предоставляются изображения шаблонов с исправлением CTF, и что внутренне A _k вычисляется путем применения заданной функции передачи контрастности (CTF) микрофотография к шаблонным изображениям. Таким образом, получается полностью скорректированный с помощью CTF алгоритм выбора.

2.2. Сортировка частиц

Новый алгоритм сортировки обеспечивает быстрый способ идентифицировать неправильно выбранные частицы из данных.Для каждого извлеченного изображения частицы P, _i программа сортировки вычитает ассоциированное изображение шаблона A _k в его заданной плоскости ϕ . Полученное разностное изображение используется для вычисления произвольного количества статистических признаков. Если P _i соответствует истинной частице, то разностное изображение должно содержать только фоновый шум. Если P _i было неправильно выбрано как частица, то разностное изображение будет содержать особенности, которые нельзя описать только фоновым шумом.Поскольку сортировка зависит от наличия шаблонного изображения, ее можно выполнять на любом этапе обработки изображения, когда каждой частице назначено 2D-изображение шаблона: то есть сразу после автоматического выбора или после любого 2D или 3D классификация или уточнение. После двухмерной классификации и автоматического выбора A _k будет соответствовать одному из используемых 2D-шаблонов K ; после трехмерной классификации или уточнения A _k будет соответствовать проекциям трехмерных шаблонов в заданном направлении.

Сам алгоритм сортировки аналогичен описанному в Scheres (2010), где вычисляется оценка Z для произвольного количества признаков в каждой частице, а затем все частицы сортируются на основе среднего значения всех этих Z — баллы. Все функции алгоритма сортировки в RELION основаны на различии изображений между каждой частицей и ее выровненным шаблоном. В частности, они включают среднее значение, стандартное отклонение, асимметрию и эксцесс разностного изображения; а также стандартное отклонение между стандартными отклонениями, рассчитанными в четырех квадрантах разностного изображения.Все эти значения рассчитываются в пределах маски M _i (C).

Полученные в результате средние баллы Z могут затем использоваться для отображения частиц в отсортированном виде. Частицы с высоким средним баллом Z часто являются высококонтрастными ложными срабатываниями, такими как лед, белковые агрегаты, угольные края или куски мусора, например C. Следовательно, визуальный контроль частиц на верхнем уровне отсортированных средних баллов Z может быть более эффективным способом избавления от плохих частиц, чем проверка всего набора данных.

Выбор частиц для данных KLH. (A) Десять средних классов без опорных значений (упорядоченных от большего к меньшему классам), которые были рассчитаны на основе вручную выбранных частиц. Два класса, отмеченные звездочкой, были выбраны в качестве шаблонов для автоматического выбора. (B) Кривые точности, отзыва и частоты ложных открытий относительно порогового значения выбора. Был выбран порог комплектации 0,3. (C) 15 частиц с наивысшим средним баллом Z после сортировки. (D) 15 самых больших классов (упорядоченных от большего к меньшему) после двухмерного усреднения автоматически выбранных частиц.Частицы, отнесенные к классам, отмеченным звездочкой, были отобраны для последующего трехмерного уточнения. (E) 3D-карта после уточнения полуавтоматически выбранных частиц из комбинированных наборов данных KLH, близких к фокусу (NTF) и далеко от фокуса (FFF).